Programa de Pós
Programa de Pós
Programa de Pós
Programa de Pós----Graduação em Parasitologia
Graduação em Parasitologia
Graduação em Parasitologia
Graduação em Parasitologia
ANTÔNIA CLAUDIA JÁCOME DA CÂMARA
ANTÔNIA CLAUDIA JÁCOME DA CÂMARA
ANTÔNIA CLAUDIA JÁCOME DA CÂMARA
ANTÔNIA CLAUDIA JÁCOME DA CÂMARA
Variabilidade genética de amostras do
Trypanosoma
cruzi
isoladas no semiárido potiguar, RN.
Belo Horizonte, MG
Belo Horizonte, MG
Belo Horizonte, MG
Belo Horizonte, MG
2008
2008
2008
2008
Antônia Claudia Jácome da Câmara
Variabilidade genética de amostras do Trypanosoma cruzi isoladas no
semiárido potiguar, RN
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia, Departamento de Parasitologia Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências/Parasitologia.
Área de Concentração: Protozoologia
Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Maria da Cunha Galvão, Departamento de
Parasitologia, ICB/UFMG e Pesquisadora visitante/CNPq nos Programas de Pós-Graduação em Ciências da Saúde e Ciências Farmacêuticas, CCS/ UFRN.
Co-orientador: Prof. Dr. Egler Chiari, Departamento de Parasitologia,
ICB/UFMG
Belo Horizonte, MG
Instituto de Ciências Biológicas, UFMG 2008
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial Leopoldo Nelson.
Câmara,.Antônia Claudia Jácome da
Variabilidade genética de amostras do Tyipanosoma cruzi isoladas no semi-árido potiguar, RN / Antônia Claudia Jácome da Câmara. – Belo Horizonte (MG), 2008.
145 f.
Orientador: Lúcia Maria da Cunha Galvão. Co-orientador: Egler Chiari.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. Departamento de Parasitologia. Programa de Pós-Graduação em Parasitologia.
1. Doenças de Chagas - Tese. 2. Epidemiologia -Tese. 3. Trypanosoma cruzi – Semi-árido -Tese. 4. Triatoma brasiliensis - Tese. 5. Panstrongylus Rutzi –Tese. I. Galvão, Lúcia Maria da Cunha. II. Chiari, Egler. III. Universidade Federal de Minas Gerais. IV. Título.
RN/UF/BC CDU 616.937 (043.2)
do Departamento de Parasitologia, Laboratório de Genética Bioquímica do Departamento de Bioquímica e Imunologia, ICB/UFMG, Laboratório de Doença de Chagas do Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Centro de Biociências e Laboratório de Biologia de Parasitos e Doença de Chagas, Programas de Pós-Graduação em Ciências da Saúde e Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, UFRN.
COLABORADORES:
Profa. Dra. Andréa Mara Macedo
Departamento de Bioquímica e Imunologia/ICB/UFMG Prof. Dr. Carlos Renato Machado
Departamento de Bioquímica e Imunologia/ICB/UFMG Dr. Helder Magno Silva Valadares
Departamento de Bioquímica e Imunologia/ICB/UFMG Profa. Dra. Eliane Lages-silva
Departamento de Ciências Biológicas, UFTM Prof. MSc. Adalberto Antonio Varela-Freire
Departamento de Microbiologia e Parasitologia/CB/UFRN
Apoio Financeiro: CNPq/Edital Universal 02/2006; Edital MCT/CNPq/MS-SCTIE-DECIT
25/2006-Estudo de Doenças Negligenciadas; PPSUS/FAPERN PROJ_430_19969656; CAPES (bolsa PDI); CNPq (bolsa Pesquisador Visitante)
À memória de Meu Pai, Raimundo Francisco
Câmara, e de meu irmão, Pedro Amílcar.
À
À
À
À minha família
minha família
minha família
minha família,,,, companheira em todos os momentos, pelo carinho, amor,
compreensão, apoio e estímulo sempre.
À
À
À
À minha Mãe
minha Mãe
minha Mãe
minha Mãe Francisca Nogueira,
Francisca Nogueira,
Francisca Nogueira, exemplo de Coragem, Força e
Francisca Nogueira,
Determinação.
Ao meu irmão
Ao meu irmão
Ao meu irmão
Ao meu irmão Raimundo Câmara
Raimundo Câmara
Raimundo Câmara
Raimundo Câmara, companheiro constante em todos os
momentos, muito obrigada.
Ao meu Filho
Ao meu Filho
Ao meu Filho
Ao meu Filho Pedro Igor
Pedro Igor
Pedro Igor
Pedro Igor, minha motivação, alegria e força.
AMO vocês!
AMO vocês!
AMO vocês!
AMO vocês!
Agradecimentos Especiais
Aos Profs. Lúcia Maria da Cunha Galvão e Egler Chiari,
Vocês são meus Mestres. E, além de Mestres, amigos. E da manifestação de amizade, me compreendem e me incentivam a seguir em frente. Agradeço também a confiança depositada em mim e as conversas maravilhosas nas quais a experiência e o conhecimento científico foram sempre muito enriquecedores. Muito obrigada.
Agradecimentos
Aos Professores do Programa de Pós-graduação em Parasitologia do ICB/UFMG, representados pelo Coordenador, Prof. Pedro Marcos Linardi, pelos ensinamentos transmitidos.
Aos Professores Andréa Mara Macedo e Carlos Renato Machado, colaboradores neste trabalho, pelas sugestões e disponibilidade de seus laboratórios.
A Elias Seixas Lorosa, FIOCRUZ/RJ, pela colaboração e disponibilidade de seu laboratório.
À Professora Érika Martins Braga, Departamento de Parasitologia, ICB/UFMG, pelas sugestões no projeto e na qualificação.
Ao Professor Paulo Roberto Medeiros de Azevedo, Departamento de Estatística, UFRN, pela colaboração na realização das análises estatísticas.
A Daniella Achaar D’Ávila, pela amizade, colaboração e carinho constantes durante todo o trabalho.
A Helder Magno S. Valadares, pela colaboração, pelas sugestões, pela ajuda na execução das técnicas de biologia molecular e pela grande disponibilidade.
Ao Cardiologista Gerson Barbosa do Nascimento, Secretaria de Saúde Pública do Estado do RN, pela colaboração e atenção aos indivíduos que participaram deste trabalho.
Aos funcionários do IBAMA, Adson Borges e George, pela atenção e colaboração.
A Sumara Aparecida Ferreira, secretária do Programa de Pós-Graduação em Parasitologia, Departamento de Parasitologia, ICB/UFMG, amiga e solidária, grande exemplo de dedicação e profissionalismo.
A tia Judith N. Jácome, pelo carinho e apoio nas viagens de campo.
A Orlando Carlos Magno e Afonso Costa Viana, técnicos do Laboratório de Biologia do
Trypanosoma cruzi e doença de Chagas, Departamento de Parasitologia, ICB/UFMG, pelo incansável
e inestimável apoio técnico durante este trabalho e a amizade.
A Edson Santana, funcionário do Departamento de Microbiologia e Parasitologia, CB/UFRN, pela amizade e indispensável apoio no trabalho de campo.
A Anibal Barbosa, funcionário do Departamento de Microbiologia e Parasitologia, CB/UFRN, pela amizade e indispensável apoio.
A Kátia Barroso, do Laboratório de Genética Bioquímica, Departamento de Bioquímica e Imunologia, ICB/UFMG, pelo suporte técnico no ALF.
A Vicente Irmão, policial militar na Estação Ecológica do Seridó, pelo também indispensável apoio no trabalho de campo.
A Rosálida Estevan Nazar Lopes, Laboratório de Toxoplasmose, Departamento de Parasitologia, ICB/UFMG, pelas orientações com a técnica de imunofluorescência e pelas palavras de incentivo e apoio.
À colega e companheira de turma da Pós-Graduação, Maria de Fátima Souza, pelo apoio.
Aos estudantes de iniciação científica da UFRN, que colaboraram com este projeto em todos estes anos, Raphael Gurgel de Carvalho, Mariana Gurgel, João Paulo, Andressa e Denise.
Às pessoas que aceitaram participar deste trabalho, minha grande gratidão.
A todos aqueles que direta ou indiretamente participaram deste projeto.
“A beleza aqui é como se a gente a bebesse, em copo, taça, longos, preciosos goles servida por Deus. É de pensar que também há um direito à beleza, que dar beleza a quem tem fome de beleza é também um dever cristão".
Guimarães Rosa, em Grandes Sertões Veredas.
“Sertão, A tua beleza é tanta que o poeta canta, canta e ainda fica o que cantá”.
RESUMO
Neste estudo, vários aspectos da epidemiologia da doença de Chagas no semiárido potiguar foram avaliados. Inicialmente, uma triagem sorológica para infecção chagásica foi realizada em 1074 moradores da zona rural dos municípios de Caraúbas, Serra Negra do Norte e Caicó. A sorologia foi reativa em 6,9% das amostras, o percentual mais elevado foi 9,1% observado no município de Caraúbas, 5,1% em Serra Negra do Norte e 3,7% em Caicó. A distribuição por idade de indivíduos com sorologia reativa foi crescente da 2ª à 6ª década de vida no município de Caraúbas; em Serra Negra do Norte foi a partir da 4ª década de vida, com redução gradativa nas décadas posteriores. E, em Caicó, a sorologia foi reativa a partir da 4ª década de vida e sem alterações significativas depois desta. A persistência sangüínea do Trypanosoma cruzi foi avaliada em 66 indivíduos com sorologia reativa com as técnicas de hemocultura e PCR. Nesta avaliação, a hemocultura foi positiva em 20,3% desses indivíduos, enquanto a PCR foi positiva em 40,9%, evidenciando que a PCR foi superior à hemocultura. A infecção natural em triatomíneos capturados no ambiente silvestre e peridoméstico foi avaliada pelo exame direto e comparada com as técnicas de xenocultura e PCR. O índice de infecção natural mais elevado foi encontrado na espécie Panstrongylus lutzi em 28,3% dos exemplares examinados, enquanto o Triatoma brasiliensis em 7,5% e T. pseudomaculata 1,1%. A comparação da PCR com o exame direto e xenocultura realizados com o conteúdo intestinal destes insetos para pesquisa do parasito revelaram que a PCR também se mostrou mais sensível na detecção do kDNA do T. cruzi em todas as espécies capturadas. A identificação da fonte alimentar dos triatomíneos examinados revelou que, em todas as espécies capturadas havia vestígios de sangue humano e as principais fontes foram sangue de aves e de roedores.
A variabilidade genética foi analisada em 25 amostras do T. cruzi, isoladas de 12 indivíduos infectados e 13 de triatomíneos procedentes das regiões estudadas envolvendo quatro marcadores moleculares: domínio divergente D7 do gene rDNA 24Sα, mitocondrial citocromo oxidase subunidade II (COII), região intergênica dos genes de mini-exon (SL-IR) e microssatélites. As linhagens do T. cruzi I, II e III foram identificadas nestas amostras, revelando uma notável diversidade genética e filogenética. A exclusiva presença da linhagem T. cruzi III ou subgrupo DTU IIc foi identificada em P. lutzi e em 50% dos isolados de T. brasiliensis, demonstrada pela primeira vez no semiárido do Rio Grande do Norte. A linhagem T. cruzi II (DTU IIb) foi encontrada em 91,7% dos isolados obtidos de humanos e 50% de T. brasiliensis e o T. cruzi I em 8,3% de humanos. Outro fato interessante foi à
presença das linhagens T. cruzi III e II em isolados obtidos do T. brasiliensis, confirmando a importância desta espécie na manutenção dos ciclos silvestre e domiciliar do parasito.
O polimorfismo alélico encontrado na análise em seis loci de microssatélite revelou uma intrigante observação de isolados de T. cruzi que apresentaram uma estrutura policlonal ou aneuplóide em 36% (9/25) dos isolados incluindo os obtidos de humanos e de triatomíneos. Desses oito apresentaram padrão idêntico para todos os loci analisados e sugere uma alta adaptabilidade deste genótipo em infectar diferentes hospedeiros. O padrão de mais de dois alelos idênticos entre os isolados analisados foi observado nos loci SCLE10, SCLE11, TcTAT20 e TcAAAT6. Do total das amostras do T. cruzi, 64% mostraram padrão de um ou dois alelos, indicando que são monoclonais homozigotas ou heterozigotas. O uso dos microssatélites como marcadores genéticos para construção de árvores filogenéticas com isolados do T.cruzi indicaram claramente três agrupamentos: um formado por isolados T. cruzi III, outro grupo foi observado com o isolado T. cruzi I e o respectivo controle e um terceiro grupo formado por isolados T. cruzi II e os controles IIb e IIe. Estes dados revelaram mais uma vez a heterogeneidade dos isolados do T. cruzi no semiárido potiguar, mesmo após o estabelecimento da infecção chagásica.
ABSTRACT
In this study several aspects of the epidemiology of the Chagas’ disease on the potiguar semi-arid zone were evaluated. Initially, a serologic screening for chagasic infection was performed in 1074 inhabitants of 36 rural communities on the three studied municipalities of Caraúbas, Serra Negra do Norte and Caicó. The serology was reactive in 6.9% of the examined samples; the highest percentage was 9.1%, observed in the municipality of Caraúbas, followed by 5.1% in Serra Negra do Norte and 3.7% in Caicó. The distribution per age of individuals with reactive serology was crescent from the 2st to 6th decade of life in Caraúbas, but in Serra Negra do Norte was reactive from the 4rd decade of life, with gradual reduction in the following decades. In Caicó, the serology was reactive from the 4rd decade of life, with no significant changes after that. The blood persistence of Trypanosoma cruzi was evaluated in 66 individuals with reactive serology by the techniques of hemoculture and PCR. In this evaluation the hemoculture was positive in 20% of the individuals, while the PCR was positive in 40.9%, evidencing that the PCR presented a major capacity of detecting the parasite than the hemoculture. The natural infection in triatomines captured on silvatic and peridomestic environment was also evaluated by the direct exam and compared with xenoculture and PCR. The rate of natural infection was higher on P. lutzi, at 28.3% of the examined examples, while 7.5% on T. brasiliensis and 1.1% of T. pseudomaculata. The comparison between PCR, direct exam and xenoculture, carried out with bugs’ intestinal content to screen the parasite, revealed that the PCR has also been more sensible to detect T. cruzi kDNA in all captured species. The identification of the alimentary source of the examined triatomnes revealed that, in all the captured species there were traces of human blood and the main sources were blood of birds and of rodents.
The genetic variability was studied in 25 Trypanosoma cruzi stocks from infected individuals and triatomine bugs involving four PCR-based genomic markers: domain divergent D7 of rDNA 24Sα gene, mitocondrial citocromo oxidase subunidade II, intergenic region of spliced-leader DNA genes and microsatellite. The lineages I, II and III were identified in those samples revealing a remarkable genetic and phylogenetic diversity. The exclusive presence of the T. cruzi III or subgroup DTU IIc was identified in P. lutzi and in 50% of T. brasiliensis isolates, and observed for the first time on the potiguar semi-arid zone. The T. cruzi II (DTU IIb) lineage was found in 91.7% of isolates obtained from humans and in 50% of T. brasiliensis isolates, while the T. cruzi I (DTU I) was found in 8.3% of human stock. Another interesting fact was the presence of T. cruzi III and II lineages in T.
brasiliensis isolates, confirming the importance of this specie for the maintenance of silvatic and domestic cycles of the parasite.
Moreover, the allelic polymorphism found in the analysis with six microsatellite loci revealed an intriguing observation of T. cruzi isolates that presented a polyclonal or identical aneuploidy structure among 36% (9/25) of the isolates including those obtained from the humans and triatomines. Eight of them presented identical pattern for all the analyzed loci and suggests a high adaptability of this genotype for infecting different hosts. This profile suggests a high adaptability of this genotype on infecting different hosts. This pattern of more than two identical alleles was observed on loci SCLE10, SCLE11, TcTAT20 and TcAAAT6. Sixty-eight percent out of the total T. cruzi samples showed a pattern of one or two alleles, suggesting that they are homozygote or heterozygote monoclonal. The usage of microsatellites as genetic markers for the construction of T. cruzi phylogenetic trees clearly indicated three clusters: the first one formed by stocks of T. cruzi III, another group was observed with stocks of the isolated T. cruzi I and its respective control, and a third cluster formed by isolated T. cruzi IIb and the controls II and IId. These data revealed once again the heterogeneity of T. cruzi on potiguar semiarid even after the establishment of the chagasic infection.
LISTAS DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 Mapa do Brasil e da região Nordeste, em destaque o Estado do Rio Grande do Norte mostrando os municípios de Serra Negra do Norte, Caicó e Caraúbas... 52 FIGURA 2 Gel de poliacrilamida a 6% corado pela prata representativo dos
perfis do rDNA 24Sα de duas amostras do T. cruzi de indivíduos infectados (RN8-462 e RN13-611) e 11 de triatomíneos. PM: Marcador de peso molecular de 1kb (kilobases); Controles: DNA do T. cruzi clone CL Brener (fragmento de 125 bp, rDNA grupo 1); clone Col1.7G2 (fragmento de 110bp, rDNA grupo 2); clone SO3cl5 (fragmentos de 110 e 125bp, rDNA grupo ½) e cepa 4166 (fragmentos de~117/119bp, cepa associada ao zimodema 3); CN: controle negativo... 76 FIGURA 3 Gel de poliacrilamida a 6% corado pela prata representativo dos
perfis do gene mitocondrial citocromo oxidase subunidade II do
T. cruzi após digestão dos produtos com a enzima AluI (RFLP-Restriction Fragment Lenght Polymorphism), de duas amostras
isoladas de indivíduos chagásicos (RN08-462 e RN13-611) e 11 de triatomíneos. PM: Marcador de peso molecular de 25kb; Controles: DNA do T. cruzi do clone Col1.7G2 apresentando perfil de 81 e 265pb (haplótipo A); CL Brener 81 e 294pb (haplótipo B) e JG com perfil de 81 e 212pb (haplótipo C); CN: controle negativo... 78 FIGURA 4 Gel de poliacrilamida a 6% corado pela prata representativo dos
perfis do espaçador intergênico dos genes de mini-exon (SL-IR) do T. cruzi em amostras isoladas de indivíduos e de triatomíneos. PM: Marcador de peso molecular de 25kb; Controles: DNA do T.
cruzi dos clones Col1.7G2, CL Brener e da cepa JG apresentando
perfil de ~150-157pb, e 3869 (~200pb); CN: controle negativo... 79 FIGURA 5 Eletrofluorogramas obtidos a partir do seqüenciador automático
de DNA(ALF-Automatic laser fluorescent) para para o locus TcAAAT6. (A) Três isolados apresentando um perfil policlonal idêntico; (B) Três isolados apresentando perfil homozigoto... 84 FIGURA 6 Rede de Wagner construída pelo método de máxima parcimônia,
MCLF10, TcTAT20, TcAAT8, e TcAAAT6) em 16 isolados do
Trypanosoma cruzi do RN e cinco controles (clones Col1.7G2 ,
CL Brener, SO3cl5 e cepas JG e 3869)... 88 FIGURA 7 Árvore filogenética construída por UPGMA por análises de seis
loci de microssatélites (SCLE10, SCLE11, MCLF10, TcTAT20,
TcAAT8, e TcAAAT6) em 16 isolados do Trypanosoma cruzi do RN e cinco controles (clones Col1.7G2 , CL Brener, SO3cl5 e cepas JG e 3869)... 89 GRÁFICO 1 Percentual de indivíduos examinados separados quanto ao
sexo... 68 GRÁFICO 2 Proporção de positividade da Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) e da hemocultura (HC) em 66 amostras de sangue de indivíduos com sorologia reativa para doença de Chagas... 70 GRÁFICO 3 Proporção de concordância de resultados da Reação em Cadeia
da Polimerase (PCR) e/ou da hemocultura (HC) em 66 amostras de sangue de indivíduos com sorologia reativa para doença de Chagas... 71
LISTA DE TABELAS E QUADROS
TABELA 1 Características e referências dos iniciadores usados para detecção e caracterização do Trypanosoma cruzi... 59 TABELA 2 Características relacionadas aos loci de microssatélites analisados
para caracterização do Trypanosoma cruzi... 63 TABELA 3 Distribuição da reatividade sorológica anti-Trypanosoma cruzi em
número e percentagem de indivíduos por município... 67 TABELA 4 Avaliação dos indivíduos com sorologia reagente em relação à
idade... 67 TABELA 5 Distribuição e o percentual dos indivíduos examinados por
idade... 68 TABELA 6 Distribuição do percentual dos indivíduos com sorologia reagente
por idade... 69 TABELA 7 Positividade da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e da
hemocultura (HC) nos indivíduos reativos e não reativos sorologicamente para doença de Chagas procedentes dos municípios estudados no RN... 69 TABELA 8 Infecção natural pelo T. cruzi detectada por diferentes técnicas em
espécimes Panstongylus lutzi, Triatoma brasiliensis e
T.pseudomaculata capturados no RN... 72
TABELA 9 Comparação de proporções da positividade de diferentes técnicas para a detecção do T. cruzi em P. lutzi, T. brasiliensis e
T.pseudomaculata capturados no RN... 73
TABELA 10 Infecção natural pelo T. cruzi em P lutzi, T brasiliensis e
T.pseudomaculata nos diferentes estágios evolutivos... 73
TABELA 11 Identificação de fonte alimentar pelo teste da precipitina para as diferentes espécies de triatomíneos capturados no RN... 75 TABELA 12 Características e classificação dos isolados do Trypanosoma cruzi
por amplificação dos genes 24Sα do DNA ribossomal (24Sα rDNA), mitocondrial citocromo oxidase da subunidade II (COII) e espaçador intergênico do mini-exon (SL-IR)... 80 TABELA 13 Distribuição dos grupos do Trypanosoma cruzi em amostras
isoladas de triatomíneos e de indivíduos infectados... 82 TABELA 14 Tamanho dos alelos em pares de bases para cada um dos seis loci
cruzi obtidos de indivíduos e de triatomíneos naturalmente
infectados... 85 QUADRO 1 Dados epidemiológicos, resultados dos testes sorológicos e
parasitológicos dos indivíduos participantes do estudo, procedentes de Serra Negra do Norte, RN... 136 QUADRO 2 Dados epidemiológicos, resultados dos testes sorológicos e
parasitológicos dos indivíduos participantes do estudo, procedentes de Caicó, RN... 137 QUADRO 3 Dados epidemiológicos, resultados dos testes sorológicos e
parasitológicos dos indivíduos participantes do estudo, procedentes de Caraúbas, RN... 138 QUADRO 4 Distribuição dos resultados da pesquisa de anticorpos
anti-Trypanosoma cruzi por localidade no município de Serra Negra do
Norte, RN... 141 QUADRO 5 Distribuição dos resultados da pesquisa de anticorpos
anti-Trypanosoma cruzi por localidade no município de Caicó, RN... 142
QUADRO 6 Distribuição dos resultados da pesquisa de anticorpos
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS API Armadilha da Parede Iluminada
A.L.F. Automated laser fluorescent
BSA Bovine Serum Albumina
CB Centro de Biociências
CO II Citocromo Oxidase subunidade II DNA Ácido Desoxirribonucléico dNTP Desoxinucleotídeo trifosfato
DTU Discrete Typing Unit
EDTA Ácido Etilenodiamino Tetracético ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ESEC Seridó Estação Ecológica do Seridó
FIG. Figura (s)
FNS/ FUNASA Fundação Nacional de Saúde
ƒmol fentomol
ha Hectare
HAI Hemaglutinação Indireta
HC Hemocultura
IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IDEMA-RN Instituto de Desenvolvimento Econômico e Meio Ambiente do Rio Grande do Norte
IFI Imunofluorescência Indireta
ITS Internal Transcribed Spacers - espaçadores internos transcritos
Kb Kilobase
kDNA DNA do cinetoplasto
Km Kilometro
Km2 Kilometro quadraso
KRT Krebs-Ringer-Tris
Low TE Tris-HCl-EDTA
LIT Liver Infusion Tryptose
LSSP-PCR Low Stringency Single Specific Primer
MDS Multidimensional scaling
MLEE Multilocus Enzyme Eletrophoresis
ml Mililitro
mM Milimolar
ng nanograma
nm nanômetro
pb pares de bases
PBS Salina tamponada com fosfato PCDEN Programa de Controle de Endemias
PCR Polimerase Chain Reaction - Reação em cadeia da polimerase
pH potencial Hidrogeniônico
PlA Panstrongylus lutzi Adulto
PM Peso Molecular
pmol Picomoles
PTC100 Programmable Thermal Controller
RAPD Random Amplified Polymorphic
rDNA DNA ribossomal
RFLP Restiction Fragment lenght Polymorphism
RNA Ácido Ribonucléico
RN Rio Grande do Norte
rpm rotação por minuto
s Segundo
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
SL-IR Intergenic Region of Spliced-Leader
TAB. Tabela (s)
TbA Triatoma brasiliensis Adulto
TbN Triatoma brasiliensis ninfa
TA Tampão da Amostra
TBE Tris-Borato-EDTA
TE Tampão Tris-EDTA
UFMG Universidade Federal de Minas Gerias. UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte UPGMA Unweighted Pair-Group Method Analysis
v Volume XC Xenocultura Z Zimodema µg Micrograma µl Microlitro µM Micromolar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 23
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 25
2.1 Doença de Chagas: situação atual... 25
2.2 Aspectos epidemiológicos na região Nordeste... 25
2.3 Ciclos epidemiológicos do parasito... 29
2.4 Morbidade... 29
2.5 Genoma do T. cruzi... 31
2.5.1 Genoma mitocondrial ... 31
2.5.2 Genoma nuclear... 32
2.6 Diversidade intraespecífica do T. cruzi ... 33
2.6.1 Biológica... 33 2.6.2 Bioquímica... 34 2.6.3 Genética... 36 2.6.4 Microssatélites... 42 3 OBJETIVOS... 45 3.1 Objetivo Geral... 45 3.2 Objetivos Específicos... 45 4 MATERIAL E MÉTODOS... 46 4.1 Delineamento experimental ... 47
4.2 Área de estudo da infecção chagásica... 48
4.3 Seleção dos indivíduos... 50
4.4 Captura e exame de vetores... 51
4.5 Isolamento do T. cruzi... 52
4.6 Reação em cadeia da polimerase (PCR)... 52
4.6.1 Coleta de sangue e extração do DNA... 52
4.6.2 Condições da reação de PCR... 53
4.6.3 Detecção dos produtos da PCR... 53
4.7 Caracterização molecular do T. cruzi... 54
4.7.1 Cultura acelular e obtenção de massa úmida do T. cruzi... 54
4.7.2 Extração do DNA... 54
4.7.3 Amplificação do gene 24Sα do DNA ribosomal (rDNA)... 56
4.7.4 PCR do gene Mitocondrial citocromo oxidase subunidade II (CO II)... 56
4.7.5 Espaçador intergênico dos genes mini-exon de T. cruzi (SL-IR)... 57
4.7.6 Microssatélites... 58
4.7.7 Construção das árvores filogenéticas... 60
4.8 Análises estatísticas... 61
5 RESULTADOS... 64
5.1 Triagem sorológica para a infecção pelo T. cruzi... 64
5.2 Positividade da PCR e hemocultura dos indivíduos procedentes dos diferentes municípios... 64
5.3 Detecção do T. cruzi no conteúdo intestinal dos triatomíneos... 68
5.4 Fonte alimentar dos triatomíneos pelo teste da precipitina... 71
5.5 Caracterização molecular do T. cruzi... 71
5.5.1 Amplificação domínio divergente D7 do gene 24 Sα (rDNA)... 71
5.5.2 Amplificação do gene mitocondrial citocromo oxidase subunidade II (CO II)... 74
5.5.3 Espaçador intergênico dos genes de mini-exon do T. cruzi (SL-IR)... 74
5.5.4 Microssatélites... 80
5.5.4 Análises filogenéticas... 85
6 DISCUSSÃO... 89
6.1 Aspectos epidemiológicos da infecção chagásica no semiárido potiguar... 89
6.1.1 Triagem sorológica... 89 6.1.2 Detecção da infecção pelo Trypanosoma cruzi... 91 6.1.2.1 PCR e Hemocultura em indivíduos... 91 6.1.2.2 Exame direto, xenocultura e PCR em triatomíneos... 93 6.1.3 Triatomíneos, ecótopos e fonte alimentar... 96 6.2 Caracterização molecular das populações do T. cruzi... 97 6.2.1. Marcadores rDNA 24Sα, SR-IL e COII... 97 6.2.2 Microssatélites... 102 7 CONCLUSÕES... 107 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 110 9 ANEXOS... 135
1
1. INTRODUÇÃO
A doença de Chagas é endêmica exclusivamente nos países das Américas Central e do Sul. Apesar do sucesso do programa de controle vetorial, ainda existem 10 milhões de indivíduos infectados e 40 milhões vivendo em risco de infecção (SCHOFIELD et al., 2006). A transmissão vetorial do Trypanosoma cruzi depende da domiciliação do vetor originário de ecótopos silvestres ou introduzidos na casa por ação humana (DIAS, 2000).
Durante o primeiro inquérito nacional, a região Nordeste foi relatada como a segunda em número de indivíduos infectados e no índice de infestação de triatomíneos (CASTRO-FILHO & SILVEIRA, 1979). No segundo inquérito, em 1996, foi a região com o número mais elevado de triatomíneos capturados, que correspondeu a 69,2% do total de insetos; e em 122.027 amostras de sangue de indivíduos de 7 a 14 anos 0,08% apresentou sorologia reativa, enquanto o percentual no país foi de 0,14% (SILVEIRA & VINHAES, 1998).
No Rio Grande do Norte, os dados sobre a doença de Chagas e outros aspectos referentes ao T. cruzi se resumem aos inquéritos sorológicos e aos dados entomológicos nacionais. Dados recentes relatam que o índice de infecção natural dos triatomíneos pelo T.cruzi é de 2,61%, sendo o segundo maior índice de infecção do Nordeste (DIAS et al., 2000). Esses insetos são capturados com facilidade em todo o semiárido potiguar, que corresponde a 90% do seu território, abrangendo desde o sertão até o litoral. As espécies Triatoma brasiliensis, T. pseudomaculata e Panstrongylus lutzi são freqüentemente encontradas nas comunidades rurais do Seridó Potiguar (CÂMARA et al., 2003). A situação epidemiológica da doença de Chagas nessa região é bastante diferente em função das principais espécies de vetores que são endêmicas, das características sociais, políticas e econômicas geralmente, entendidas como complicadoras do sucesso do programa de controle (DIAS et al., 2000).
No Estado, existem espécies comprovadamente autóctones ou potencialmente transmissoras do T. cruzi, demonstrada pela presença constante de T. brasiliensis e T. pseudomaculata e ainda pela emergência de espécies como P. lutzi. Por isso, a área é caracterizada como área de risco de transmissão, segundo o Consenso Brasileiro em Doença de Chagas (2005). Essa área deve ter uma abordagem diferenciada na vigilância epidemiológica dependente de conhecimento prévio das possíveis fontes de infecção, caracterização dos isolados do parasito predominante na região e as formas de contato do vetor infectado com o homem susceptível.
Nos ciclos de transmissão do T. cruzi, o modo natural da interação deste parasito com os vetores, os reservatórios e a doença humana – que poderá ou não se adaptar estritamente no
ambiente da moradia – são conhecidos em diversas áreas. Todavia, as diferentes populações do parasito que circulam entre esses hospedeiros apresentam uma elevada heterogeneidade intra-específica, tanto estrutural como funcional, como tem sido demonstrado com cepas isoladas de diferentes hospedeiros, vertebrados e invertebrados.
Considerando esses aspectos, neste trabalho, foi realizada inicialmente uma triagem sorológica na zona rural, em indivíduos a partir de oito anos de idade (conforme termo de consentimento aprovado pelo COEP-UFMG Nº 312/06), residentes nos municípios de Serra Negra do Norte, Caicó e Caraúbas localizados nas microrregiões do Seridó e Chapada do Apodí, respectivamente. Além disso, foi realizado o exame dos triatomíneos capturados com a finalidade de analisar os aspectos epidemiológicos da doença de Chagas nessa área e analisar, por parâmetros moleculares, as populações do T. cruzi isoladas de indivíduos sorologicamente reagentes e de triatomíneos capturados nos diferentes ambientes: domiciliar, peridomiciliar e/ou silvestre. Essa abordagem permitiu estudar as interações que ocorrem nos eventos de associação do parasito com o hospedeiro vertebrado na região do semiárido do Estado do Rio Grande do Norte.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Doença de Chagas: situação atual
Dentro do contexto de saúde pública na América Latina, a doença de Chagas representa um problema relevante. O objetivo básico da iniciativa do cone Sul, em 1991, foi alcançado pela interrupção da transmissão do T. cruzi, principalmente com medidas de eliminação do principal vetor, T. infestans, e pela seleção segura de doadores em bancos de sangue (DIAS, 2007). Assim, as estimativas apontam para redução da prevalência da infecção pelo T. cruzi, que progressivamente passou de 16 a 18 milhões de indivíduos infectados em 1990 para aproximadamente 10 milhões em 2006 e 40 milhões de indivíduos vivendo em áreas de risco (SCHOFIELD et al., 2006). Entretanto, a doença de Chagas permanece uma prioridade em saúde pública, pela necessidade de vigilância e controle em áreas onde o vetor silvestre pode invadir domicílios, pelos custos médico e social no cuidado de indivíduos infectados com o tratamento específico. Outros fatores igualmente importantes são a dificuldade na obtenção de prioridade para atividades de controle e eliminação do vetor em áreas onde a transmissão pelos triatomíneos foi interrompida e a necessidade de contínuo reforço na seleção de doadores de sangue em áreas endêmicas e não endêmicas (MOREL & LAZDINS, 2003).
No Brasil, as ações de controle da transmissão vetorial têm se mostrado efetivas, não somente pelos indicadores entomológicos, mas também pela ausência de indivíduos jovens infectados pelo T. cruzi. O último inquérito sorológico realizado em escolares de 7 a 14 anos entre 1989-1997 analisou 225.000 amostras de 842 municípios em 18 estados e demonstrou que a média de prevalência da infecção chagásica foi 0,14%, com índices variáveis como 0,00% nos Estados de Alagoas, Maranhão e Mato Grosso a 0,70% no Rio Grande do Sul (SILVEIRA & VINHAES, 1998, 1999). Nos centros urbanos, os casos de infecção chagásica humana também vêm apresentando queda significativa. A prevalência de indivíduos sororreagentes entre doadores da rede pública, que na década de 70 era superior a 2%, em 2002 foi de 0,62% (XII INCONSUR, 2003). Em relação à transmissão congênita, a prevalência varia de 1 a 4%: em Salvador 0,9% (BITTENCOURT, 2000), Brasília 2,6% (MEDINA-LOPES, 1983), Minas Gerais 1,7% (GONTIJO et al., 1998) e São Paulo de 1-3% (ARTEGA-FERNANDEZ, 1987).
2.2 Aspectos epidemiológicos na região Nordeste
O programa de controle em doença de Chagas iniciado em 1975 compreendia 36% do território brasileiro e o objetivo era a eliminação dos vetores mais importantes, T. infestans e P. megistus. Esse programa consistia na aplicação de inseticidas no interior dos domicílios e
anexos peridomiciliares, a fim de interromper os ciclos de transmissão envolvendo o vetor, animais reservatórios e o homem. A área de estudo incluiu 2.493 municípios nos Estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Espírito Santo, Goiás, Piauí, Rio de Janeiro, Rio Grande do Norte, Rio Grande do Sul, Sergipe, Tocantins e o Distrito Federal. Atualmente, apenas os Estados da Bahia, Tocantins, Goiás e Rio Grande do Sul são considerados infestados pelo vetor principal, o T. infestans (MONCAYO, 2003). No entanto, não podemos descartar o envolvimento de outras espécies de triatomíneos, no ciclo de transmissão do T. cruzi ao homem e animais, presentes no peridomicílio e intradomicílio de diferentes localidades nos Estados brasileiros, especialmente se não houver vigilância sobre as ações de controle aos vetores do protozoário.
Na região Nordeste, as espécies de triatomíneos encontradas na maioria dos Estados são o T. brasiliensis e T. pseudomaculata, à exceção da Bahia e do Maranhão, onde predominam o T. sordida e o T. rubrofasciata, respectivamente (SILVEIRA & VINHAES, 1998). Esses dados são também assinalados em inquéritos realizados na Paraíba, por Lucena & Costa (1954); no Ceará, por Alencar (1965); no Piauí, por Coura et al. (1996) e no Rio Grande do Norte, por Castro-Filho & Silveira (1979) e por Câmara et al. (2003).
Na Paraíba, Lucena & Costa (1954) chamaram a atenção para os triatomíneos das espécies T. brasiliensis e T. maculata predominantes no sertão com índices de infecção pelo T. cruzi de 17,1% e 2,8% respectivamente, mas com baixa infestação domiciliar. Em 132 domicílios incluindo o peridomicílio foram capturados 16 exemplares de T. brasiliensis e nenhum espécime se encontrava infectado pelo T. cruzi (COURA et al., 1996). No último inquérito entomológico nacional as espécies T. brasiliensis e T. pseudomaculata foram predominantes. Enquanto a presença do T. infestans foi registrada neste Estado até o ano de 1992 (SILVEIRA &VINHAES, 1998).
Dados sobre o inquérito sorológico inicialmente realizado em 19/42 municípios da Paraíba revelou positividade de 19,9% das amostras para o T. cruzi. A positividade sorológica desse inquérito foi 19,5%, 17,9%, 23,1%, respectivamente, para a zona da mata, agreste e sertão (LUCENA & COSTA, 1957). Estes dados foram drasticamente reduzidos para 3,5% em 1980 e no inquérito realizado em escolares de 7-14 anos entre 1993-95 identificou apenas 0,16% de amostras reativas (SILVEIRA &VINHAES, 1998).
A presença do T. infestans no Estado de Pernambuco foi relatada inicialmente no município de Cumaru, localizado no agreste, por Lucena et al. (1965). Esses autores sugeriram que a introdução dessa espécie ocorreu no período de 1955-1965 e 20,26% dos moradores do município de Nazaré da Mata foram sorologicamente positivos para o T. cruzi (LUCENA et al., 1965).
No Estado do Ceará, tem sido registrado como espécie predominante o T. brasiliensis com 15,4% de infecção pelo T. cruzi em 2.837 exemplares capturados. Entre os roedores capturados foram encontrados infectados 2/35 de Thrichomys apereoides (punaré); 1/1 de Bolomys lasiurus (rato pixuna); 41/160 de Rattus rattus frugivorus (rato doméstico); 4/32 de Rattus rattus alexandrinus (rato doméstico). Entre marsupiais foram encontrados 7/7 de Didelphis paraguayensis (cossaca). O ciclo doméstico de transmissão do T. cruzi estaria sendo mantido por ratos domésticos, enquanto o ciclo peridoméstico pelo cossaca ou gambá, animais que se alimentam próximo das residências e nelas adentram à procura de alimentos, os quais se tornam escassos nos arredores (ALENCAR, 1965). Deane & Deane (1957) encontraram 28,6% dessa mesma espécie de gambás infectados pelo T. cruzi em um total de 217 exemplares capturados no noroeste do Estado. Estudos recentes sobre a epidemiologia da doença de Chagas em quatro localidades no Ceará demonstraram que o índice de infecção natural dos triatomíneos pelo T. cruzi variou entre 10,8-30,2%, dependendo da espécie e do local onde os insetos foram capturados. A espécie T. brasiliensis ainda continua sendo a mais encontrada no intradomicílio e peridomicílio com índices de infecção de 10,7 e 15,7%, respectivamente (SARQUIS et al., 2004).
No Estado do Rio Grande do Norte (RN), a fauna triatomínica observada é bastante variada: P. diasi, P. lutzi, P. megistus, Rhodnius nasutus, T. brasiliensis, T. pessoai, T. pseudomaculata e T. rubrofasciata, com predominância de 69% em T. pseudomaculata e 26% em T. brasiliensis (CASTRO-FILHO & SILVEIRA, 1979). O primeiro inquérito sorológico publicado em 1980 revelou 1,8% de prevalência da infecção chagásica em 34.164 de indivíduos positivos. O segundo inquérito realizado em escolares de 7-14 anos de idade, no período de 1989-1997, mostrou a positividade sorológica de 0,20% no total de 12.583 amostras examinadas em 116 municípios, o que representou uma redução de 89% na prevalência comparada ao inquérito anterior. No período entre 1993-1996, não houve alteração em relação ao número de triatomíneos capturados nas unidades domiciliares, permanecendo prevalentes as espécies T. brasiliensis e T. pseudomaculata, independente das ações realizadas em todos esses anos do programa de controle (SILVEIRA & VINHAES, 1998). Em 1996, 13.195 coletas de sangue foram realizadas no Centro de Hematologia e Hemoterapia do RN (HEMONORTE) e 0,25% dos candidatos a doação de sangue foram reativos na sorologia para T. cruzi. Aproximadamente 115 municípios encontram-se dentro da área endêmica de doença de Chagas e, desses, apenas 12 passaram à fase de vigilância epidemiológica em 1995. É fato também que, no RN, as ações de controle sempre foram
descontinuadas, devido à falta de recursos humanos, insumos e inseticidas (PCDEN-FUNASA, 1989-1995).
O RN apresenta uma extensão territorial de 53.077,3km2 que representa 3,14% da região Nordeste e 0,62% do território nacional. A população do Estado é de 3.013.740 habitantes, segundo dados estimados e recenseados em 2007 (IBGE, 2008). O RN limita-se ao Norte e Leste com o Oceano Atlântico, ao Sul com o Estado da Paraíba e a Oeste com o Ceará. Politicamente está dividido em 167 municípios, agrupados em quatro mesorregiões: Oeste, Central, Agreste e Litorânea (FIG. 1). Aproximadamente 90% do território são incluídos dentro do semiárido, sendo que este abrange desde o sertão até o litoral. A mesorregião central divide-se ainda em cinco microrregiões: Macau, Angicos, Serra de Santana, Seridó Ocidental e Seridó Oriental, enquanto a mesorregião Oeste está subdividida em microrregiões: Mossoró, Chapada do Apodi, Médio Oeste, Vale do Açu, Serra de São Miguel, Pau dos Ferros e Umarizal. (ANUÁRIO ESTATISTICO DO RN, 2006).
O Seridó potiguar, localizado no sul geográfico do Estado, a presença humana no Seridó potiguar está registrada por riquíssimos testemunhos da arte rupícula, desde 10.000-9.000 a.C., em três tradições características, confirmando pelo menos três grupos humanos ou três estilos diferentes. Na época histórica, os Tarairiu, um povo do grande tronco lingüístico Macro Ge, dominaram toda a região. Durante a guerra dos Bárbaros (nos últimos dez anos do século XVII), esse povo foi literalmente dizimado pela colonização européia procedente, sobretudo, da Galícia e dos Açores. Ambos os grupos humanos usaram, durante essa guerra, o recurso de “tocar fogo na mata” como estratégia de guerra, o que possivelmente explica o aspecto atual do Seridó, um verdadeiro pré-deserto, cujo índice de aridez alcança 3,3 (VARELA-FREIRE, 2000).
O uso das cercas de pedra nesta região, tradição açoriana típica, aliado ao extermínio progressivo da mastofauna nativa e de espécies da Ordem Cingulata, Euphractus sexcinctus (tatu-peba) e o Dasypus novemcinctus (tatu verdadeiro), que até então compunham a cadeia epidemiológica da doença de Chagas silvestre, além da construção de casas de taipa resultaram na mudança de habitat dos triatomíneos. Estes insetos, à mercê de um ambiente domiciliar e peridomiciliar, mas isento de predadores, tornaram-se um problema sócio-sanitário (VARELA-FREIRE, 2000). Sendo uma região de contrastes extremos de temperatura e umidade, encontra-se uma fauna de insetos muito bem adaptada a essas condições. Isso implica uma variação considerável de representantes das diversas Ordens no decorrer do ano. Na fauna entomológica predominam como, ordens mais abundantes, Coleóptera, Lepidóptera, Hymenoptera, Orthoptera, Neuroptera, Mantodea, Díptera e
Hemíptera (VARELA-FREIRE, 2000). Na ordem Hemiptera, família Reduviidae e subfamília Triatominae, segundo relatórios da FUNASA/RN (1989-1995), são encontradas como espécies predominantes o T. brasiliensis, o P. megistus, o T. pseudomaculata, o P. lutzi, o Rhodnius nasutus e o T. petrochii.
A microrregião da Chapada do Apodi, a vegetação é do tipo caatinga hiperxerófila e apresenta terras planas ligeiramente elevadas formadas por terrenos sedimentares cortados pelos rios Apodi-Mossoró e Piranhas-Açu, as principais bacias hidrográficas do Estado. Abrange parte dos municípios envolvidos na economia salineira e possui importantes reservas de petróleo e gás natural (ANUÁRIO ESTATISTICO DO RN, 2006).
2.3 Ciclos epidemiológicos do parasito
O ciclo biológico do T. cruzi é alternado entre hospedeiros invertebrados e vertebrados de diversas ordens, caracterizando os diferentes ciclos epidemiológicos da doença: doméstico, peridoméstico e silvestre. O ciclo silvestre envolve a interação entre hospedeiros invertebrados (triatomíneos) e vertebrados (marsupiais, carnívoros, roedores, primatas, mamíferos silvestres dentre outros animais), em ecótopos naturais do Continente Americano (DIAS, 1992; FERNANDES et al., 1998). Os ciclos doméstico e peridoméstico são resultantes do contato entre o homem e o vetor, como conseqüência de modificações sociais e ecológicas provocadas pelo próprio homem, permitindo assim a colonização de ecótopos artificiais pelos triatomíneos (DIAS, 1992). O ciclo peridoméstico envolve animais domésticos que atuam como reservatórios do T. cruzi e, triatomíneos silvestres atraídos às residências pela luz e pelo alimento. Este ciclo tem grande importância epidemiológica, pois atua como elo entre os ciclos doméstico e silvestre (DIAS, 2000). A caracterização molecular de isolados do parasito de diferentes hospedeiros dos ciclos doméstico e silvestre no Brasil tem demonstrado que estes ciclos podem ocorrer de maneira independente, podendo algumas vezes se sobrepor (MILES et al., 1977; SOUTO et al., 1996; ZINGALES et al., 1998; MILES et al., 2003).
2.4 Morbidade
A infecção chagásica humana se inicia com características peculiares e apresenta uma gama de manifestações que variam em freqüência e intensidade, formadas por sinais de porta de entrada, sintomas gerais e alterações sistêmicas e com um quadro clínico oligossintomático, principalmente em adultos (RASSI et al., 2000). A maioria das manifestações clínicas da doença de Chagas humana é devido à sensibilização do sistema
imune pelo T. cruzi resultando em respostas humorais e celulares específicas dirigidas contra o parasito. Esta ação levará à redução da carga parasitária, mas poderá contribuir para o aparecimento de lesões crônicas observadas em alguns pacientes, uma vez que tanto aqueles assintomáticos (forma indeterminada) quanto os sintomáticos apresentam resposta imune contra o parasito (BRODSKYN & BARRAL-NETO, 2000). Em geral, a fase crônica pode durar vários anos ou persistir indefinidamente e, na maioria dos casos, apresenta uma forma indeterminada sem sintomas com eletrocardiograma e RX do coração, esôfago e cólon normais. Esses casos podem evoluir para as formas clínicas cardíaca, digestiva ou cardiodigestiva, com várias características patológicas, tais como danos no sistema nervoso periférico e/ou disfunção gastrointestinal, relacionadas com a localização e intensidade das lesões. A cardiopatia chagásica crônica pode apresentar prognóstico e evolução variáveis, oscilando de pequenas alterações eletrocardiográficas até insuficiência cardíaca ou progressão para uma eventual morte súbita (COURA et al., 1983, DIAS et al., 1992). Dentre as características da cardiopatia chagásica crônica, se destacam de maneira especial, seu caráter fibrosante, além da freqüência e complexidade das arritmias cardíacas e a combinação com distúrbios da condução do estímulo atrioventricular e intraventricular, a grande incidência de morte súbita, fenômenos tromboembólicos e aneurismas. A forma digestiva da doença de Chagas pode acometer todos os órgãos do trato gastrintestinal, manifesta-se pelo acometimento do esôfago e do intestino grosso, levando ao aparecimento de megaesôfago e megacólon, respectivamente (CONSENSO BRASILEIRO EM DOENÇA DE CHAGAS, 2005).
Há uma grande variabilidade regional na morbidade da doença de Chagas e a forma indeterminada pode variar entre 40-90% dos casos (COURA et al., 1985, 1999). Esta variabilidade das manifestações clínicas e morbidade podem ser atribuídas, em parte, à eficácia da resposta imune e aos aspectos genéticos dos indivíduos infectados, mas tem sido relatado que se deve primariamente à complexidade da estrutura populacional do T. cruzi (MILES et al., 1981; TIBAYRENC & AYALA, 1999). Dados da literatura têm demonstrado que a resposta imune do hospedeiro participa no controle da multiplicação do parasito nos tecidos. Na passagem do T. cruzi no hospedeiro invertebrado para o homem, o parasito deve sofrer pressão seletiva do sistema imunológico desse hospedeiro com conseqüente destruição de alguns clones menos resistentes, uma vez que ambas subpopulações de linfócitos TCD4+ e CD8+ exercem um papel ativo no controle da infecção pelo T. cruzi (ROTTENBERG et al., 1995). Em pacientes chagásicos crônicos, a caracterização do infiltrado inflamatório através de fenotipagem das células e análises de citocinas teciduais associadas com a presença ou
ausência de antígenos do parasito nas lesões, sugerem que a resposta Th2 estaria associada com a disseminação do parasito, e a resposta do tipo Th1 com o controle do parasitismo tissular, uma vez que pequena quantidade de antígenos do T. cruzi foi relacionada com elevadas taxas de interferon γ (IFN γ) e a intensa concentração de antígenos com a citocina IL-4 (HIGUCHI et al., 1993a e b). As células presentes no infiltrado inflamatório de pacientes com formas cardíacas são principalmente células TCD8+, com número reduzido de células T CD4+ (HIGUCHI et al., 1993a; TOSTES et al., 1994). O número baixo de células T CD4+ nas lesões cardíacas (HIGUCHI et al., 1993a e b) e a diminuição de células CD4+ no sangue periférico de pacientes com formas avançadas de megaesôfago (REIS et al., 1996) sugerem que algum tipo de imunossupressão deve estar associada com conseqüente participação na evolução das formas sintomáticas da doença de Chagas. Estes resultados sugerem que a persistência e densidade dos parasitos nos tecidos do coração e esôfago na fase crônica da doença de Chagas parecem que estão fortemente associados aos processos patológicos desenvolvidos pelos hospedeiros nestes órgãos. Outros trabalhos têm sugerido que a lesão principal na doença de Chagas é a rejeição de células alvo, parasitadas ou não, pelo sistema imune do hospedeiro, a hipótese de teoria auto-imune (TEIXEIRA et al., 1975, KIERSENBAUM 1999, TARLETON, 2001). Apesar de controvérsias na literatura, esses dados devem ser importantes na evolução dos processos patológicos da doença de Chagas crônica.
Estudos experimentais avaliando diferentes parâmetros biológicos como taxa de crescimento, metaciclogênese, patogenicidade, tropismo tecidual e sensibilidade aos compostos com atividade anti-T. cruzi têm sido desenvolvidos mostrando uma forte ligação à variabilidade genética do parasito (DVORAK, 1984; TIBAYRENC, 1998; ZINGALES et al., 1999). Dados recentes demonstraram que a infecção experimental com isolados do T. cruzi II induz 100% de mortalidade dos animais, enquanto na infecção com isolados do T. cruzi I todos os animais alcançam a fase crônica, e sugerem que os tripomastigotas de cepas T. cruzi II expressam e excretam quantidades mais elevadas de transialidase que aquelas T. cruzi I (RISSO et al., 2004).
No Brasil, estudos sobre a morbidade da doença de Chagas acompanhados desde 1975 demonstraram que existem diferenças regionais, classificando-as em áreas de alta e baixa morbidade (COURA et al., 1999). No Estado de Minas Gerais, os municípios de Iguatama e Pains (COURA et al., 1984, 1985), Virgem da Lapa (BORGES-PEREIRA & COURA, 1986) e no Piauí, o município de Oeiras (MONTOYA-ARAÚJO, 1998), são consideradas áreas de alta morbidade. A prevalência oscila entre 10,4-17,1%; as percentagens de cardiomiopatia
chagásica variam entre 18-23,4%, e a letalidade é de 2% paciente/ano. As áreas de baixa morbidade incluem os Estados da Paraíba e Mato Grosso do Sul. A prevalência sorológica em oito distritos no sertão da Paraíba foi de 9,5% na Paraíba (BORGES-PEREIRA & COURA, 1987; BORGES-PEREIRA et al., 1990; COURA et al., 1996; BORGES-PEREIRA et al., 1998) e, em 12 distritos no Mato Grosso do Sul, a prevalência foi de 1,8%. Estudos posteriores revelaram que a cardiopatia chagásica era encontrada em 15% e 12,8% dos indivíduos infectados, respectivamente (BORGES-PEREIRA et al., 2001).
Na década de 90, dados sobre a hospitalização no setor público de pacientes apontam para um declínio no número de casos crônicos da doença de Chagas e para uma drástica diminuição de casos agudos nas áreas conhecidas como, hiperendêmicas, o que traduz o impacto sobre a transmissão vetorial no país. Apesar da dificuldade em demonstrar o decréscimo da mortalidade devido ao caráter evolutivo crônico da doença, resultados preliminares mostram redução do número de mortes atribuído à doença de Chagas de 5/100.000 habitantes na década de 80 para 3,5 nos recentes anos (SILVEIRA & VINHAES, 1999). Os mecanismos que levam os diferentes pacientes a desenvolver as diferentes formas clínicas e os fatores determinantes dessa heterogeneidade geográfica ainda permanecem desconhecidos, e também não podem ser explicados apenas pelas principais diferenças genéticas entre a população humana habitante dessas áreas endêmicas. Acredita-se que eles são determinados, primariamente, pela variação genética do T. cruzi, mas não pode ser descartado o papel ambiental e nutricional, assim como os aspectos imunológicos relacionados ao hospedeiro (MACEDO et al., 2004).
2.5. Genoma do T. cruzi
2.5.1 Genoma mitocondrial
Os membros da família Trypanosomatidae apresentam uma organela típica denominada cinetoplasto, a qual é constituída por DNA (kDNA) que representa 10-20% do DNA celular total (SIMPSON, 1972; STUART, 1983) e sua função é análoga à mitocôndria dos eucariotos superioresque codifica os RNAs ribossômicos e as enzimas envolvidas na respiração celular. O cinetoplasto se multiplica independentemente do DNA genômico e está organizado em uma rede complexa de moléculas circulares formando os maxi e minicírculos. O kDNA do T. cruzi é composto de aproximadamente 20-50 cópias de maxicírculos, com 40.000pb (pares de base) e por 5.000 a 10.000 cópias de minicírculos, com cerca de 1400pb (SIMPSON, 1987). Os maxicírculos assemelham-se ao DNA mitocondrial de eucariotos superiores e apresentam uma região conservada e uma região variável codificando RNA ribossomal e proteínas
necessárias para a biogênese mitocondrial (MYLER, 1993). Os genes das proteínas mitocondriais (citocromo oxidases, citocromo b, ATPases, NADH desidrogenase) e dos rRNAs mitocondriais estão localizados no maxicírculo.
Os minicírculos representam 95% do DNA total do cinetoplasto (SIMPSON & SILVA, 1971) e 10% deles são constituídos por quatro regiões conservadas de 118pb com 80% de homologia entre elas, situadas a intervalos de 90° dentro de um minicírculo e são denominadas minirepeats. Essas regiões estão intercaladas por quatro regiões de seqüências variáveis, aproximadamente de 330pb (LEON et al., 1980; MACINA et al., 1986; DEGRAVE et al., 1988). Devido ao elevado número de cópias, os minicírculos do kDNA de T. cruzi têm sido utilizados como alvos preferenciais para a detecção do parasito pela PCR no sangue de animais experimentalmente infectados (STURM et al., 1989), no sangue de pacientes chagásicos (AVILA et al., 1991, 1993; WINCKER et al., 1994, GOMES et al., 1998; BURGOS et al., 2007), nas fezes de triatomíneos (BRITO et al., 1995; BRENIÈRE et al., 1995; MARCET et al., 2006) e em tecidos cardíaco, esofágico e cólon de pacientes chagásicos crônicos (VAGO et al., 2000; 2003).
As seqüências das regiões conservadas dos minicírculos são estáveis entre as espécies da família e podem ser empregadas como critério taxonômico, sendo capazes de definir afinidades evolutivas e grau de homologia entre as espécies. A análise de fragmentos clonados dos minicírculos do T. cruzi (SANCHEZ et al., 1984) e do kDNA do Trypanosoma brucei, T. gambiense e T. rhodesiense usando enzimas de restrição revelam que cada cepa, dentro de uma mesma espécie, apresenta um padrão único e característico (BORST et al., 1981). Dentro de uma mesma espécie, os minicírculos exibem tamanhos relativamente uniformes, mas são heterogêneos em seqüência (STEINERT & VAN ASSEL, 1980) e aqueles com as mesmas seqüências nucleotídicas dentro da rede de kDNA são agrupados em classes características, sendo em T. cruzi aproximadamente 20 classes (RIOU & YOT, 1977).
2.5.2 Genoma nuclear
O conteúdo de DNA nuclear do T. cruzi por célula varia de 125 a 330fg (fentogramas), incluindo o DNA do cinetoplasto (MCDANIEL & DVORAK, 1993; HENRIKSSON et al., 1996). O genoma do T. cruzi é constituído de 9-14% de seqüências altamente repetitivas, 35% medianamente repetitivas e 50% de genes de cópia única (CASTRO et al., 1981). A maioria dessas seqüências é específica para o T. cruzi, não apresenta hibridização cruzada com nenhum outro tripanossomatídeo (REQUENA et al., 1996), considerada seqüência alvo para os métodos moleculares e empregada na detecção do parasito em triatomíneos, amostras de
sangue e soro e em tecidos de pacientes chagásicos (MOSER et al., 1989; RUSSOMANDO et al., 1992, 1996; JONES et al., 1993).
Estudos envolvendo a ploidia em T. cruzi sugerem uma constituição predominantemente diplóide para o genoma deste parasito. Várias evidências apóiam essa idéia, tais como análises de polimorfismo de isoenzimas que evidenciam desvio no equilíbrio de Hardy-Weinberg e um forte desequilíbrio de ligação (TIBAYRENC et al., 1986; TIBAYRENC, 1995; OLIVEIRA et al., 1998, VALADARES et al., 2008), também tem sido relatados em estudos com hibridização de marcadores genéticos com duas bandas cromossômicas (GIBSON & MILES, 1986; HENRIKSSON et al., 1990). No entanto, existem trabalhos que sugerem a ocorrência de poliploidias e/ou aneuploidias pelo menos em alguns cromossomos específicos do T. cruzi (CAMPETELLA et al., 1992; HENRIKSSON et al., 1996; OLIVEIRA et al., 1999; GAUNT et al., 2003; OBABO et al., 2008). A existência de um intenso polimorfismo cromossômico, tanto em número quanto em tamanho entre cepas e clones do T. cruzi, pode ser responsável por essas variações de conteúdo de DNA (DVORAK, 1993; HENRIKSSON et al., 1996).
O genoma nuclear completo do T. cruzi, representado pelo clone CL Brener, foi recentemente publicado. Estima-se que o tamanho do genoma diplóide seja entre 106,4 e 110,7Mb (megabases), sendo que pelo menos 50% do genoma é composto por seqüências repetitivas, consistindo principalmente por grandes famílias de genes que codificam para proteínas de superfície, retrotransposons e repetições subteloméricas. Cerca de 60% do genoma parece codificar proteínas, sendo preditos 22.570 produtos gênico dos quais pouco mais da metade (12.570) representam cópias alélicas (EL SAYED et al., 2005).
2.6. Diversidade intraespecífica do Trypanosoma cruzi 2.6.1 Biológica
A variabilidade das características biológicas e comportamentais do T. cruzi tem sido observada desde os relatos de Chagas (1909), assinalando as diferenças marcantes na morfologia das formas tripomastigotas sangüíneas do parasito. Posteriormente, diversos estudos demonstraram que, no sangue periférico de animais infectados com diferentes cepas do T. cruzi, eram encontradas formas tripomastigotas delgadas, largas e muito largas (SILVA, 1959; BRENER & CHIARI, 1963; BRENER, 1965). A diversidade do T. cruzi em relação às características biológicas, morfológicas, imunológicas e patogênicas, observada em diferentes hospedeiros e, aliada aos outros fatores ainda não bem determinados, levou a denominação de “complexo cruzi” (COURA et al., 1966; DEVERA et al., 2003).
Um tropismo preferencial de populações do T. cruzi por determinados tecidos ou órgãos do hospedeiro tem sido evidenciado experimentalmente com cepas isoladas no México (GALLIARD, 1965) e Recôncavo Baiano (ANDRADE, 1974). O parasitismo tecidual induzido pelas cepas Y, Berenice e ABC (isoladas de seres humanos) e pela cepa CL (isolada de triatomíneo naturalmente infectado) também foi avaliado e observada uma localização preferencial dos parasitos por macrófagos ou por células musculares, classificando-as em reticulotrópicas ou macrofagotrópicas e miotrópicas (MELO & BRENER, 1978).
A análise de vários parâmetros biológicos e histopatológicos das cepas do T. cruzi em animais experimentais permitiu agrupá-las em três tipos ou biodemas (ANDRADE, 1985). Estudos biológicos e isoenzimáticos confirmaram a relação existente entre os biodemas e zimodemas das cepas do T. cruzi de diferentes regiões geográficas (ANDRADE et al., 1983). É provável que a variabilidade biológica, a expressão das diversas manifestações clínicas da doença de Chagas e as diferenças regionais na morbidade estejam relacionadas às variações intra-específicas das subpopulações do T. cruzi descritas no estudo dos clones (ARAÚJO & CHIARI, 1988; CAMANDAROBA et al., 2001). Tendo como base critérios relacionados às características dos picos de parasitemia, taxa de mortalidade, predomínio de formas largas ou delgadas, tropismo tecidual e comportamento histopatológico, as cepas do T. cruzi foram agrupadas em biodemas I, II e III, classificação esta proposta por Andrade & Magalhães (1997). A heterogeneidade de populações do T. cruzi também foi demonstrada com a presença simultânea dos biodemas II e III no oeste e norte do Estado de Minas Gerais (DEVERA et al., 2002). Apesar desta evidência, os biodemas, em geral, têm uma distribuição ubíqua, com a tendência do predomínio de um tipo em uma mesma área (ANDRADE & MAGALHÃES, 1997) com padrões biológico e isoenzimático semelhantes e, sugestivo da presença de clones dominantes. A presença de clones principais poderia ser responsável por um tropismo predominante do parasito por um determinado órgão e tecido responsáveis por manifestações da doença e a susceptibilidade às drogas observada em pacientes nessas áreas (ANDRADE, 1999; CAMPOS et al., 1999).
O polimorfismo genético da população do T. cruzi parece exercer um papel importante na patogênese da doença de Chagas crônica, uma vez que camundongos BALB/c infectados simultaneamente com duas populações do parasito mostraram uma distribuição tecidual diferenciada para cada uma delas, evidenciada por meio de técnicas moleculares (ANDRADE et al., 1999). Existem evidências de que, durante a fase aguda da infecção chagásica, as populações do T. cruzi provavelmente são geneticamente mais complexas que aquelas
isoladas durante a fase crônica, o que sugere uma seleção de populações com especificidade diferenciada para invasão tecidual (OLIVEIRA et al., 1997, 1999).
2.6.2 Bioquímica
A análise de zimodemas tem sido amplamente aplicada na caracterização genética de cepas e clones do T. cruzi, por meio da técnica de eletroforese de enzimas, demonstrando uma grande heterogeneidade fenotípica das populações. O polimorfismo genético do T. cruzi ao nível de proteínas foi inicialmente descrito por Toyé (1974), que relatou a variabilidade do T. cruzi por isoenzimas. Posteriormente, as cepas do T. cruzi isoladas de vários hospedeiros (humanos, animais domésticos e silvestres e vetores) foram agrupadas de acordo com as diferenças e semelhanças dos diversos perfis eletroforéticos de isoenzimas e classificadas em três zimodemas (Z1, Z2, Z3) por Miles et al. (1977), e em quatro (ZA, ZB, ZC, ZD) por Romanha (1982). A comparação entre os zimodemas Z2 e ZA mostra que os dois são equivalentes, sendo encontrados no Brasil seis zimodemas principais correspondentes ao Z1, Z2 ou ZA, Z3, ZB, ZC, e ZD. Destes, o Z2 estaria associado ao ciclo doméstico, enquanto o Z1 seria encontrado principalmente em animais e vetores do ciclo silvestre e em chagásicos na fase aguda da infecção. Um terceiro zimodema (Z3) foi demonstrado e também associado ao ambiente silvestre (MILES et al., 1977, 1980). Empregando a taxonomia numérica foi demonstrada a existência dos três grupos distintos do T. cruzi coincidentes com os zimodemas 1, 2 e 3 (READY & MILES, 1980; MILES et al., 1978). Esses achados foram corroborados por outros autores e assinalaram outros fatos relevantes, tais como a presença do Z1 no ciclo silvestre associado ao homem, animais domésticos e peridomésticos, em amostras do T. cruzi procedentes do Estado da Bahia (BARRET et al., 1980).
A análise de um maior número de loci ou marcadores enzimáticos pode permitir identificar um variado número de zimodemas e diferenciar aqueles que seriam idênticos. Tibayrenc et al. (1986) empregando 15 loci e analisando o perfil enzimático de 645 amostras do parasito de diferentes hospedeiros e diversos países, encontraram elevada variabilidade genética, identificando pelo menos 43 zimodemas ou clonets distintos.
A análise de isoenzimas e das seqüências do kDNA constituíram a base da proposta da estrutura de população clonal do T. cruzi (LAURENT et al., 1986; MILES et al., 1980). A hipótese do modelo clonal de populações do T. cruzi (TIBAYRENC & AYALA, 1991) foi demonstrada pela ausência de segregação e recombinação genética deste parasito, que tem sido demonstrado pelos estudos de isoenzimas, em que o número de zimodemas encontrado para o T. cruzi é bastante inferior ao das possíveis combinações teóricas dos genótipos em cada locus, caracterizando um forte desequilíbrio de ligação. Outras evidências como o
