2.2.1.3. Diffusion statique de la lumière en milieu turbide (3DLS)

La diffusion classique de la lumière nécessite que les échantillons soient transparents c’est-à- dire que le phénomène de diffusion multiple n’existe pas : l’intensité collectée par le détecteur n’a été diffusée que par une seule particule. Dans les solutions turbides, un photon diffusé de façon multiple ne porte pas la même information qu’un photon diffusé une seule fois :

Imesurée = Idiffusion simple + Idiffusion multiple II. 18 Les techniques classiques qui permettent de lier l’intensité diffusée (diffusion simple) à la structure des systèmes restent donc parfaitement valables pour le traitement de l’intensité diffusée mesurée en 3DLS, une fois la diffusion multiple soustraite et la correction pour la turbidité de l’échantillon prise en compte.

Pour obtenir des informations sur la structure d’une solution turbide, il faut donc soustraire les photons diffusés de façon multiple.

Figure II. 4: Schéma du principe de la diffusion de lumière en milieu turbide

En pratique, comme le montre le schéma représenté sur la figure II. 4, deux faisceaux L1 et L2 provenant de la même source traversent la solution et sont détectés par deux photomultiplicateurs PM1 et PM2. La corrélation entre la lumière diffusée par les deux faisceaux est :

G2(t) = <IL1(t).IL2(t)> II. 19

Si on a seulement de la diffusion simple de lumière, l’intensité mesurée par les deux PM sera en phase. Par contre, quand le phénomène de diffusion multiple intervient, la phase mesurée par les deux PM sera décorrélée pour les photons diffusés de multiple fois. L’intercepte

d L2 diffusion multiple

d L1 diffusion simple d L2 diffusion simple l=680nm

LASER

PM2

PM1 L1

L2

mesuré G2(t®0)mesuré sera alors inférieur à l’intercepte idéal mesuré pour une solution transparente. La fraction de photons diffusés une fois s’écrit donc sous la forme :

5 . 0

0 5 . 0

2 2

) 0 (

) 0

( ÷÷

ø ö ççè

=æ

÷÷ø ö ççè

æ

®

= ®

B B t

G t F G

idéal mesuré

s II. 20 où B est l’intercepte de la fonction de corrélation croisée de la solution étudiée et B0 celui d’un échantillon référence transparent.

Les mesures de diffusion de la lumière réalisées au cours de cette étude ont été effectuées à 20°C en utilisant la technique de diffusion en milieu turbide. L’appareil utilisé est une version commerciale de l’instrument de corrélation croisée 3D (LS Instrument, Fribourg, Suisse). La source lumineuse est un laser diode de longueur d’onde 680 nm.

II.2.2.2. Microscopie confocale à balayage laser en mode fluorescence

En microscopie à fluorescence classique, on a une perte de résolution de l’image due à l’excitation des fluorochromes se situant hors du plan focal. En effet, les fluorochromes sont excités par le laser sur toute l’épaisseur de la préparation, ce qui se traduit par une image contaminée par un bruit de fond. Le principe de la microscopie confocale à balayage laser (MCBL en français et CLSM pour confocal laser scanning microscopy en anglais) est d’éliminer la lumière provenant des plans défocalisés qui parasite le plan focal.

Le principe de l’appareil est donné sur la figure (figure II. 5) :

Figure II. 5: Schéma de principe du microscope confocal à balayage laser

Le rayon laser excitateur pénètre dans l’échantillon préalablement marqué par des fluorochromes, auparavant choisis en fonction de leurs capacités à se fixer sur les sites particulièrs d’une structure ou d’un objet d’intérêt. Lors de l’impact optique, il y a émission des rayons lumineux provenant de différents plans de la préparation. Grâce à un diaphragme variable (pinhole), il est possible de sélectionner les rayons émis par un seul plan de la préparation et d’éliminer ainsi le signal provenant des autres plans. Ces rayons réfléchis sont filtrés en fonction de leur longueur d’onde, puis détectés par des photomultiplicateurs. Le signal reçu est enfin converti en signal numérique conduisant à la création d’une image.

La MCBL comprend donc des lasers, des éléments optiques, des dispositifs de balayage rapide et des ordinateurs qui traitent numériquement les images.

En positionnant le plan focal de l’objectif à différents niveaux de profondeur dans l’échantillon, il est possible de réaliser des séries d’images à partir desquelles on peut reconstruire une représentation tridimensionnelle de l’objet.

Laser

Photomultiplicateur

Filtre d’émission Pinhole de sortie

Miroir dichroïque

Objectif

Plan focal Échantillon

Pinhole d’entrée

Z

Les clichés de MCBL ont été réalisés avec un microscope inversé Leica TCS-SP2 (Leica Microsystems Heidelberg, Allemagne) équipé de 3 lasers qui regroupent 6 raies : 458, 488, 514, 543 et 633 nm et en utilisant différents objectifs à immersion eau ou huile. Pour nos observations, l’objectif à immersion huile n’est pas adéquat parce que la différence d’indice de réfraction entre le milieu d’immersion et la préparation est trop grande. L’objectif HCx PL APO 63x 1,2W à immersion eau a été utilisé, bien qu’il ait un champ d’observation réduit, car il a une meilleure résolution.

La valeur du gain a été choisie dans un domaine où le bruit est négligeable et où il n’y a pas de saturation. On est entre 560 et 580V pour 5 ppm de rhodamine RITC.

Le mode xyz a été choisi pour sonder l’échantillon dans les 3 dimensions. En général, pour des mesures quantitatives, il faut se mettre en xyz de façon à éviter les effets interfaciaux sur la structure (il faut regarder dans le cœur de l’échantillon).

La protéine marquée est observée en utilisant un laser à la longueur d’onde de 543nm (le PMT : émission enregistrée entre 555 et 700 nm). Les solutions de référence ou les mélanges préalablement chauffés à 60°C pendant 5 min sont placées dans les puits de labtek et regardées immédiatement. Les observations sont ensuite faites à 20°C à différents endroits de l’échantillon pour moyenner.

II.2.2.3. Rhéologie

Les produits peuvent être caractérisés rhéologiquement de différentes manières, notamment en régime oscillant ou en régime permanent.