Observation des images prises immédiatement après mélange (t 0 )

Les mélanges sans ou avec 0.1M NaCl (ou 0.1M KCl) et à pH 7 sont observés par microscopie confocale à balayage laser (MCBL). Les protéines sont marquées avec la rhodamine RITC à 5ppm et sont colorées en blanc sur les photos. Les mélanges de KC et SC ont été préparés pour des concentrations de SC allant jusqu’à 100g/L et des concentrations de KC allant jusqu’à 15g/L. Les images prises immédiatement après mélange à 20°C sont montrées dans les figures III. 1, 2, 4 et 7. Toutes les images confocales ont une taille de 160 mm, sauf indication contraire. Les clichés des mélanges obtenus en utilisant différents protocoles d’agitation (manuelle ou vortex) et différentes températures de chauffage (50- 80°C) sont identiques.

III.1.1.1. Système sans sel ou en présence de sel non spécifique (NaCl) et à pH 7

Figure III. 1: Images confocales des mélanges SC/KC à des concentrations indiquées dans la figure, en absence de sel et pH 7.

Figure III. 2: Images confocales des mélanges SC/KC à des concentrations indiquées dans la figure, à 0.1M NaCl et pH 7.

Dans les systèmes en absence ou en présence de sel (figures III. 1 et 2), on observe 2 situations :

- A faible concentration de SC et de KC, le système est homogène (Figure III. 3a) mais évolue avec le temps comme nous le verrons dans la suite du chapitre.

- A haute concentration de SC, on observe une microséparation de phase ségrégative (incompatibilité thermodynamique). Avec le temps, la séparation de phase ségrégative peut devenir macroscopique avec une phase supérieure riche en KC et une phase inférieure riche en SC (Figure III. 3b).

Figure III. 3: Systèmes homogènes (a) et systèmes hétérogènes (b) à 0.1 M NaCl et pH 7.

A haute concentration de SC, on trouve des inclusions riches en KC dans une matrice continue riche en SC. A haute concentration de KC, on a une inversion de phases, avec des inclusions riches en SC dans une matrice continue riche en KC. Pour des concentrations intermédiaires, on observe une décomposition de type spinodale avec la formation rapide de 2 domaines bicontinus (figure III. 4).

Figure III. 4: Evolution cinétique d’un système hétérogène sans sel, à pH 7 et avec une hauteur relative proche de 50/50. SC 60g/L et KC 3g/L. La hauteur relative est le rapport entre le volume des 2 phases. Durée= 2 min.

Juste après le mélange à 60°C, le système est homogène et instable (hors équilibre). Puis rapidement, il y a une décomposition spinodale (processus brusque et rapide) qui se traduit dans un premier temps par la formation de microdomaines riches en SC dans un réseau continu riche en KC (figure III. 4). Ensuite, on observe des domaines bicontinus et enfin, une séparation de phase macroscopique.

Les différents états observés à un instant t que ce soit dans un mélange sans ou avec sel dépendent de la concentration des biopolymères et donc, de leur viscosité.

Nous observons par ailleurs, à la fois dans les mélanges homogènes et hétérogènes, des agrégats irréversibles riches en protéines. Le SC forme des agrégats avec le KC (coloration rouge), voir figure III. 5 et paragraphe 2.

Figure III. 5: Profil d’intensité des agrégats pour un mélange contenant 3g/L de SC et 4g/L de KC (100mM NaCl et à pH 7).

Comme nous l’avons dit dans le chapitre bibliographique, l’agrégation et la séparation de phase dans les mélanges SC et KC n’avaient pas été étudiés systématiquement, bien que certains auteurs avaient montré une séparation de phase pour des mélanges de micelle de caséines natives et de kappa carraghénane sous forme hélice (Bourriot, Garnier and Doublier, 1999b; Langendorff, Cuvelier, Michon, Parker and De Kruif, 2000; Schorsch, Jones and Norton, 2000). Dans ces systèmes, quelques grammes par litre de KC étaient suffisants pour induire une séparation de phase. La séparation de phase dans ces systèmes avait été attribuée soit à un phénomène de déplétion, soit à un phénomène d’incompatibilité thermodynamique.

Ces auteurs n’avaient pas observé de précipitation car la micelle de caséine était complètement recouverte de KC, ce qui peut expliquer l’absence d’agrégation entre les micelles de caséines et le kappa carraghénane.

III.1.1.2. Etude du contraste

Le contraste est défini comme le rapport du signal lumineux de la phase riche en SC sur le signal de la phase pauvre en SC. La figure III. 6 donne l’évolution du contraste en fonction de la concentration en caséinates de sodium et de la concentration en kappa carraghénane sans ou avec sel et à pH 7.

40µm Intensité

~5µm

Figure III. 6: Evolution du contraste en fonction de la concentration en protéines à différentes concentrations en KC indiquées sur les figures, en absence de sel (a) et en présence de 0.1M NaCl (b), à pH 7.

Le contraste augmente systématiquement avec la concentration de SC. Pour une concentration donnée en SC, le contraste augmente avec l’augmentation de la concentration en KC. On observe également que le contraste est plus élevé pour un système mixte en présence de NaCl que pour un système mixte sans sel. La séparation de phase est donc favorisée en présence de NaCl et à hautes concentrations en biopolymères, comme, l’a été décrit dans la littérature pour des mélanges de micelle de caséines et de polysaccharides.

III.1.1.3. Système en présence de sel spécifique (KCl) et à pH 7

Dans cette partie, on utilise un sel spécifique de KC : le KCl à 0.1M pour que la gélification se fasse immédiatement pendant le refroidissement à 20°C car à 0.1M KCl, le KC gélifie vers 50°C. On observe une micro séparation de phase autour des mêmes concentrations de protéine que pour les systèmes à 0.1M NaCl.

Figure III. 7: Morphologie des systèmes gélifiés pour des mélanges à 0.1 M KCl ou 0.1M NaCl, à 4g/L de KC et à différentes concentrations de SC indiquées sur la figure.

En présence de potassium, on n’observe jamais une séparation de phase complète à 20°C car les hélices de KC s’agrègent et gélifient. Le système est figé dans son évolution et le contraste est faible.