Contrôle de la souche réceptrice

Dans la stratégie de construction de la cassette toxique inductible, les deux gènes toxiques sont clonés dans un vecteur similaire à celui qui sera utilisé pour la construction du système de contre sélection final. Ce choix permet de contrôler l‟efficacité des gènes toxiques dans le vecteur final utilisé. Ce vecteur ne possèdant pas le gène lacI^q, celui-ci a été inséré dans le chromosome de la souche hôte (sous chapitre III-1) pour éviter d‟augmenter la taille de la cassette toxique inductible. Seul le gène répresseur araC est apporté dans la cassette toxique inductible pour les raisons évoquées ci-après.

Figure 11 : Carte de restriction de pB33C3

Dessin réalisé avec le logiciel pDRAW32 d’après la séquence reconstruite de pB33C3. En orange : la cassette toxique, en bleu : les sites de restriction unique, en rouge : les sites de restriction double. Pc : promoteur de l’ORF araC, O1 et O2 : séquences opératrices, I1 et I2 : sites d’initiation de la transcription, CAP : site de fixation de la protéine CAP pour la répression catabolique.

Le gène lacI^q a donc été transféré dans le chromosome dans la souche E. coli 1661, via la cassette [P3 ::immE3-kn^r-lacI^q] selon le mode opératoire décrit dans le sous chapitre III-2.

La fonctionnalité de immE3 a auparavant été contrôlée, notamment par la capacité de la souche à acquérir par transformation un plasmide contenant le gène colE3 (tests réalisés avec les plasmides pB33C3 et pPRE, voir sous chapitre III-1 et sous chapitre III-2). La fonctionnalité de lacI^q a été vérifiée par transformation avec succès du plasmide pSK360 dans la souche E. coli 1661LIΔara. Ce plasmide porte deux gène toxiques relF, dont l‟expression est réprimée par LacI, mais ne porte pas le gène lacI. Aussi, la transformation de ce plasmide dans E. coli 1661LIΔara n‟est permise que par l‟expression du gène lacI^q inséré dans le chromosome. La fréquence de transformation obtenue pour ce plasmide est faible, néanmoins des clones ont pu être isolés, sensibles à l‟ajout d‟IPTG en milieu liquide. Le gène lacI^q inséré est donc fonctionnel.

3.3 Construction d’une cassette toxique inductible à deux gènes toxiques

La cassette toxique inductible doit pouvoir être facilement mobilisée pour son clonage entre les régions cibles dévolues à la recombinaison du système de contre sélection. Ceci implique le clonage des deux gènes toxiques de la cassette à proximité de façon à limiter la taille de la cassette. Toutes les séquences ADN non indispensables sont dans la mesure du possible éliminées. Par ailleurs, des sites de restriction sont ajoutés aux extrémités de la cassette.

Clonage de relF dans pB33C3

Le plasmide pB33C3 contenant colE3 sous le contrôle de Pbad avait été construit dans une étape précédente (sous chapitre III-1). D‟après la carte de restriction plasmidique de pB33C3 (Figure 11), le site de restriction MluI a été identifié comme le plus adéquat pour y cloner la cassette [P_A1-O3/O4::relF-tc^r]. Après insertion de la cassette au niveau de ce site de restriction, le plasmide pB33C3RTc3G6 a pu être isolé. Ce dernier confère la résistance à la tétracycline, présente le profil de restriction attendu, et tue la cellule hôte en présence d‟IPTG.

La cassette [P_A1-O3/O4::relF-tc^r] a donc bien été insérée dans pB33C3, et le gène relF est fonctionnel. Le taux d‟échappement lié à l‟activité seule de relF est de 5.10^-4 à 5.10^-5.

Figure 12 : Stratégie de construction et de mobilisation de la cassette toxique

(1) Digestion des trois produits PCR par SgsI (AscI), NotI et NdeI puis ligation pour obtenir pB341C2RTc (2) Digestion de pB341C3RTc par SgsI (AscI) et NotI pour mobiliser la cassette toxique et (3) l’insérer via les sites NotI et SgsI (AscI) dans un vecteur contenant les deux sites de recombinaison définis pour la capture de la diversité des gènes ciblés. En orange : la cassette toxique, en bleu : les sites de recombinaison.

Cassette toxique mobilisable

(1)

(2)

(3)

Cependant l‟ajout d‟arabinose n‟entraîne plus la mort de la cellule hôte, contrairement au vecteur pB33C3. La fonctionnalité du gène colE3 aurait donc été perdue lors de l‟étape de clonage. L‟analyse de la séquence du plasmide pB33C3 indique que le site MluI utilisé pour le clonage est situé dans le promoteur du gène répresseur araC (Figure 11). Le clonage de la cassette dans son promoteur perturberait donc la répression du gène colE3 d‟une part, mais également de l‟activation de sa transcription. La présence du gène immunité dans le chromosome de la souche hôte permet la stabilisation du plasmide contenant colE3, cependant l‟absence d‟activation expliquerait la survie des cellules hôtes observée en présence de l‟inducteur arabinose.

Le clonage successif des deux gènes toxiques relF et colE3 sur un même plasmide est techniquement réalisable. Des contraintes moléculaires ne nous ont pas permis d‟obtenir une construction fonctionnelle. Les sites de restriction pour le clonage de la cassette [PA1- O3/O4::relF-tc^r] à proximité de colE3 dans pB33C3 étant en nombre limité, nous avons décidé de cloner ces deux gènes relF et colE3 sur un nouveau vecteur.

Clonage des gènes relF et colE3 dans pB341

Pour cloner les gènes colE3 et relF dans une cassette toxique finale aisément mobilisable, la stratégie de clonage suivante a été appliquée : le vecteur et les deux gènes toxiques ont été amplifiés par des couples d‟amorces portant des sites de restriction afin de réaliser un clonage orienté en une seule étape. Cette stratégie de clonage a déjà été réalisée avec succès pour le clonage de deux sites de recombinaison dans le plasmide pB342 (sous chapitre III-2). La zone de pBAD33 comprise entre Pbad et l‟ORF araC est composée de nombreux opérateurs du promoteur du gène araC ainsi que des opérateurs de Pbad, rendant délicate la séparation entre araC et P_bad. Aussi le gène araC est conjointement cloné avec P_bad ::colE3 dans la cassette toxique inductible.

Le couple d‟amorces Bad33ascIFw3 / Bad33NotIRv2 a été défini d‟après la séquence reconstruite de pBAD33 afin d‟amplifier un fragment d‟ADN qui sera utilisé comme vecteur (Figure 12). La cassette [P_A1-O3/O4::relF-tc^r] est amplifiée à partir du plasmide pSK360 par le couple d‟amorces ParelFTcAscIFw2 / ParelFTcNdeIRv5 et la cassette [araC-Pbad::colE3- rrnB] à partir de pB33C3 par le couple d‟amorces PbcolE3notIFw5 / PbcolE3ndeIRv5. Les sites de restriction SgsI, NdeI et NotI ont été ajoutés sur les amorces (par modification de nucléotides) pour le clonage orienté de chacun des produits PCR (Figure 12). La cassette toxique finale constituée de [araC-Pbad::colE3-rrnB] et [PA1-O3/O4::relF-tc^r] pourra ainsi être mobilisée par digestion avec les enzymes SgsI et NotI. L‟amplification PCR, suivie d‟une

digestion puis d‟un clonage n‟a cependant pas permis l‟obtention de transformants en dépit de la répétition des tentatives.

Dans une stratégie alternative, chacun des deux gènes toxiques a été cloné successivement sur le plasmide pB341. La cassette [araC-Pbad::colE3-rrnB] a été amplifiée par le même couple d‟amorces PbcolE3notIFw5 / PbcolE3ndeIRv5, mais seul le site de restriction NotI présent sur l‟amorce sens est utilisé pour le clonage de la cassette dans pB341.

Le plasmide pB341C3 obtenu montre une activité toxique en présence d‟arabinose. La cassette [PA1-O3/O4::relF-tc^r] est amplifiée par le couple d‟amorces ParelFTcAscIFw1 / ParelFTcascIRv2 à partir de pSK360 pour son clonage dans pB341C3. Les plasmides pB341C3RTc1 obtenus confèrent la résistance à la tétracycline, cependant l‟ajout d‟IPTG n‟entraîne pas la mort de la cellule hôte. Le profil de digestion de pB341RTc1 indique la présence d‟un insert inférieur à la taille attendue. L‟analyse détaillée du couple d‟amorces utilisées pour l‟amplification de [P_A1-O3/O4::relF-tc^r] indique une hybridation annexe sur un autre emplacement de pSK360 pouvant expliquer le clonage d‟un fragment contenant tc^r sans relF. Le sous-produit PCR pourtant non détecté sur gel a été cloné préférentiellement au produit PCR majoritaire contenant relF.

L‟obtention d‟une construction comportant les gènes relF et colE3 fonctionnels sur un même plasmide a nécessité le clonage de la cassette [P_A1-O3/O4::relF-tc^r] dans le plasmide pB341, la digestion de pB341RTc réalisée par SgsI pour ré-extraire la cassette et la cloner dans pB341C3. La souche utilisée pour toutes les réactions de clonage ne présentant pas d‟inactivation du gène hsdR (sous chapitre III-2), les produits PCR pénétrant dans la cellule lors de l‟étape de transformation sont donc dégradés et non intégrés. Ceci expliquerait les échecs de clonage rencontrés lors du clonage simultané des deux gènes toxiques dans le plasmide pB341. La souche E. coli DH5αZ1 utilisée lors de cette dernière opération de clonage est quant à elle mutée dans son système de restriction. Les ADN non méthylés entrant dans la cellule ne sont donc pas dégradés, et des clones présentant les génotypes plasmidiques et les phénotypes attendus ont pu être isolés, confirmant ainsi la validité de l‟hypothèse. Le système de modification de la souche E. coli DH5αZ1 n‟est quant à lui pas muté. Le plasmide pB341RTc extrait de cette souche est donc méthylé, par conséquent la cassette [PA1- O3/O4::relF-tc^r] issue de ce plasmide aussi. Ceci explique le recouvrement de la construction toxique attendue seulement après clonage de cette cassette issue de E. coli DH5αZ1.

L‟obtention de transformants dans la souche E. coli 1661LIΔara possédant pB341C3 malgré la possible restriction des produits PCR peut être expliquée par une saturation du système de

restriction / modification via la pénétration d‟une grande quantité d‟ADN (Nielsen et al., 1998).

Le plasmide pB341C3RTc2 obtenu comporte une cassette mobilisable constituée de 2 gènes toxiques inductibles et entraîne la mort des cellules hôtes après induction par l‟IPTG, ainsi que par l‟arabinose. Les gènes relF et colE3 fonctionnels ont pu être clonés avec succès sur un même plasmide.