Isolement de l‟ADN après lyse cellulaire ex situ

Les objectifs qui ont prévalu au développement de cette technologie visaient à s‟affranchir des biais de la voie d‟extraction directe liés à l‟adsorption de l‟ADN sur les composants du sol, aux difficultés rencontrées pour sa purification, et enfin à l‟effet délétère des traitements sur l‟état de l‟ADN. Extraire préalablement les cellules bactériennes hors de la matrice devait permettre de purifier la suspension bactérienne de la plupart des composés du sol et en particulier des acides humiques. La suspension pouvait alors être soumise à des traitements lytiques à la fois efficients pour lyser les cellules et ménagés pour ne pas dégrader l‟ADN. En d‟autres termes, la suspension bactérienne résultant de l‟extraction à partir du sol pouvait être traité selon des protocoles définis pour des cellules issus de culture pure donc parfaitement adaptés aux travaux ultérieurs de biologie moléculaire.

Pour l‟extraction des cellules, le sol est préalablement désagrégé. La méthode disruptive au Waring Blender dans un tampon phosphate est généralement utilisée, car elle permet un bon recouvrement des cellules bactériennes tout en conservant l‟intégrité cellulaire (Lindahl & Bakken, 1995; Lindahl, 1996). Les cellules sont ensuite séparées des particules grossières par centrifugation différentielle, puis des particules plus fines et autres contaminants organiques (acides humiques) par un gradient de densité (Bakken, 1985). C‟est avec le polymère Nycodenz que les gradients de densité ont permis le meilleur recouvrement des cellules bactériennes (Lindahl, 1996).

Le recouvrement d‟une information exhaustive est cependant dépendant de cette première étape de séparation des cellules de la matrice sol. Aakra et al. n‟ont par exemple pu extraire que 0,5 % des bactéries oxydant l‟ammonium (Aakra et al., 2000). Plus généralement, moins de 50 % de la diversité bactérienne sont extraits du sol (Bakken, 1985;

Robe et al., 2003; Steffan et al., 1988) pouvant atteindre exceptionnellement plus de 70 % (Bakken, 1985; Barra Caracciolo et al., 2005). Ces différences peuvent être expliquées par le pourcentage d‟argiles présent dans le sol (Bakken, 1985). L‟auteur a en effet observé une sédimentation des cellules avec les argiles. Ces dernières fermement attachées aux particules de sol ont une densité plus élevée que les bactéries, ne permettant pas leur isolement sur gradient de densité. L‟utilisation de traitements enzymatiques attaquant la matrice EPS des cellules bactériennes permettent une amélioration des rendements d‟extraction (Bockelmann et al., 2003). L‟extraction à partir de sol non séché est également recommandé, la dessiccation conduisant les cellules à un rapprochement de surface (malgré les répulsions électrostatiques) et donc à un attachement plus fort (Berry et al., 2003).

Les résultats présentés dans la littérature indiquent que l‟ADN extrait selon cette voie est de meilleure qualité comparativement à la voie directe. Bien que les acides humiques sédimentent avec les cellules lors de l‟étape de centrifugation différentielle (Bakken, 1985;

Steffan et al., 1988), ils sont en grande majorité éliminés lors de l‟isolement des cellules sur gradient de densité (Bakken, 1985; Lindahl, 1996). Le meilleur niveau de pureté de l‟ADN obtenu par cette voie d‟extraction facilite son exploitation ultérieure. Ainsi, 2 à 3 fois plus de transformants sont obtenus avec L‟ADN extrait par la voie indirecte par rapport à celui extrait par voie directe (Gabor et al., 2003).

La taille des fragments ADN extraits par voie indirecte est également bien supérieure à celle obtenue par la méthode directe. Des fragments de plus de 150 kb (Beja et al., 2000) à plus de 1 000 kb (Berry et al., 2003) ont pu être détectés. Les traitements enzymatiques (lysozyme +/- achromopeptidase) et chimiques (SDS) généralement effectués pour la lyse cellulaire ex situ (Courtois et al., 2001; Steffan et al., 1988) sont en effet beaucoup moins sévères que les traitements physiques apportés lors de la lyse in situ. Ce traitement lytique enzymatico-chimique ménagé reste néanmoins efficace puisque plus de 90 % des bactéries sont lysées, y compris lorsque le mélange comprend plus de 44 % de bactéries à Gram positif (Steffan et al., 1988). La lyse cellulaire effectuée directement dans des gels d‟agarose minimise encore les risques de dégradation mécanique de l‟ADN (Beja et al., 2000; Berry et al., 2003; Stein et al., 1996). L‟ADN est ensuite séparé du lysat par électrophorèse en champ pulsé, puis extrait du gel par l‟emploi de gélase (Beja et al., 2000; Berry et al., 2003) ou par

electroélution (Beja et al., 2000), limitant ainsi la manipulation de l‟ADN. Un autre intérêt majeur de l‟approche indirecte est l‟accès à l‟ADN intracellulaire des bactéries, excluant l‟ADN extracellulaire procaryotique persistant dans le sol mais également l‟ADN eucaryotique.

En conclusion, la voie d‟extraction indirecte ainsi que celle directe permet l‟accès jusqu‟à 60-70 % de l‟information génétique de la communauté microbienne contenue dans l‟échantillon étudié. Le facteur limitant dans les deux cas provient de l‟interaction de l‟ADN ou des cellules avec les composants du sol. Les cellules bactériennes montrant une interaction variable avec les particules de sol suivant les espèces (Stenstrom, 1989; van Loosdrecht et al., 1987), l‟accès à une diversité biaisée vers les espèces bactériennes moins fortement attachées peut être supposé. Quelques études comparent l‟influence de la méthode d‟extraction d‟ADN métagénomique sur la diversité bactérienne extraite. Les données obtenues sont cependant contradictoires suivant les études. Pour Courtois et al. (2001), les résultats observés sur des populations cibles appartenant à trois sous classes de protéobactéries, aux actinomycètes et aux bactéries à faible pourcentage GC sont globalement comparables. Gabor et al. (2003) observent une plus grande diversité par la voie d‟extraction indirecte (lyse cellulaire ex situ).

D‟autres auteurs montrent une plus forte diversité obtenue par la méthode d‟extraction directe (Luna et al., 2006). Néanmoins très peu de taxa révélés sont communs aux deux méthodes, chacune d‟entre elles offrant ainsi l‟accès à une fraction différente de la microflore tellurique (Luna et al., 2006).

5 E

Les approches moléculaires peuvent permettre l‟analyse jusqu‟à près de 50-70 % de la diversité bactérienne présente dans un échantillon de sol (Barra Caracciolo et al., 2005), soit 160-230 fois plus que par les approches classiques d‟isolement bactérien in vitro (Amann et al., 1995). Une telle quantité d‟information nécessite des approches adaptées pour leur exploitation. Plusieurs approches ont ainsi été développées (Figure 1) pour un contexte d‟étude particulier.