Contrôles et optimisations avant clonage de gènes toxiques

3.1.1 Transformabilité des cellules électrocompétentes :

La transformabilité des cellules électrocompétentes a été vérifiée par la transformation d‟un plasmide témoin. Une plus haute fréquence de transformation de plasmide pour des cellules préparées extemporanément a été constatée par rapport à celle obtenue pour les mêmes cellules stockées à -80°C (Tableau 4). Les fréquences d‟obtention des transformants comportant les constructions toxiques attendues étant parfois très faibles (voir ci-après), les transformations avec des produits de ligation contenant des gènes toxiques ont été systématiquement réalisées avec des cellules électrocompétentes préparées extemporanément.

Tableau 4 : Fréquence de transformation de plasmides dans la souche E. coli JM109 en fonction des conditions d’utilisation des souches préparées électrocompétentes

Souche E.coli plasmide T T.µg^-1 ADN T.mol^-1 ADN Condition d’utilisation

JM109 pBAD24 1,60E-03 1,07E-02 4,84E-05 extemporanément

JM109 pBAD24 1,77E-04 1,18E-03 5,35E-06 après stockage -80°C JM109 pMMB190 1,37E-04 6,86E-04 6,22E-06 extemporanément JM109 pMMB190 2,39E-05 1,20E-04 1,08E-06 après stockage -80°C

Figure 4 : Comparaison des profils de digestion entre les plasmides pMR32, pUCTc, et les plasmides extraits de transformants.

Les plasmides extraits des clones E. coli JM109 dans lesquels ont été introduits les produits de ligation de pMR32 et de l’insert contenant le gène tc^r (provenant de pUCTc) ont été digérés par l’enzyme de restriction HindIII, et comparé au profil de digestion de pUCTc et pMR32 digérés par la même enzyme. C1: « pMRTc » clone1 digéré par HindIII, C2 : « pMRTc » clone 2 digéré par HindIII, C3 : « pMRTc » clone1, C4 : « pMRTc » clone 2, C5 : pMR32 digéré par HindIII, C6 : pUCTc digéré par HindIII, C7 : pUCTc. MR (MassRuler high range) et 1Kb+ les marqueurs de taille.

1Kb+

MR

C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7

2 3 10

6 3 2 Taille

Kb

Taille Kb

Pour chaque transformation réalisée, un plasmide témoin est utilisé pour évaluer la transformabilité de chaque stock de cellules électrocompétentes. Les fréquences de transformation T obtenues pour ces plasmides témoins nous ont servi de référence interne pour évaluer les fréquences de transformation obtenues pour chaque produit de ligation. Une fréquence de transformation normalisée TN est alors calculée :

TN= T (produit de ligation) / T (plasmide témoin)

Les plasmides témoins ont été choisis en fonction des vecteurs utilisés pour réaliser le clonage. Les plasmides pMMB190 et pBAD33 ont ainsi été utilisés pour évaluer la fréquence de transformation des constructions réalisées dans ces deux vecteurs. Ce choix permet (1) de vérifier que le vecteur utilisé est capable de se répliquer de manière autonome dans la souche hôte utilisée, (2) de comparer la transformabilité normalisée TN de tous les essais de construction dérivés d‟un même vecteur.

3.1.2 Optimisations des techniques de clonage :

Les premiers essais de construction moléculaire incluant des gènes dont les fonctions sont toxiques pour la cellule se sont soldés par des échecs : soit aucun clone n‟était détecté, soit les colonies obtenues sur milieu sélectif possédaient un plasmide différent de celui attendu. Ainsi pour la construction du plasmide pMR32Tc, nous avions digéré le plasmide pUCTc par l‟enzyme HindIII, puis purifié sur gel le fragment d‟ADN correspondant au fragment contenant le gène de résistance à la tétracycline tc^r. Le vecteur pMR32 a été digéré par la même enzyme, puis déphosphorylé pour éviter sa recircularisation et ainsi favoriser sa ligation avec l‟insert. Après transformation du produit de ligation dans une souche E. coli et sélection sur tétracycline, les plasmides extraits des transformants obtenus ont montré un profil de restriction similaire à celui de pUCTc (Figure 4). Ces résultats peuvent être expliqués par la co-extraction de molécules non digérées du plasmide pUCTc. Leur transformabilité supérieure aux molécules hybrides vecteur : insert assure la production majoritaire de clones dépourvus de la construction attendue.

Ces biais, liés à une digestion imparfaite du plasmide initial, nous ont conduits à la purification des plasmides par ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium pour augmenter la pureté des plasmides extraits. Une amélioration de la digestion des plasmides ainsi purifiés a été constatée (Figure 5). Cependant la technique est longue et lourde à appliquer lorsque de nombreux plasmides sont utilisés. Pour éviter l‟utilisation de cette méthode de purification, l‟emploi d‟une seconde enzyme coupant pUCTc en un site différent du gène tc^r permet également de diminuer le nombre de molécules de plasmide non digérées.

(A)

(B) (C)

Figure 5 : Influence de la purification des plasmides par ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium sur les réactions de digestion

(A) carte de restriction de pSK360 (Knusen et al., 1995).

(B) le plasmide pSK360 (3800 ng) extrait par un kit commercial a été digéré par les enzymes de restriction HindIII et EcoRI. (C) le plasmide pSK360 (3600 ng) extrait puis purifié par ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium a été digéré par les enzymes de restriction XbaI et PvuII. La réaction de digestion dans les deux cas a été effectuée dans les mêmes conditions par les mêmes quantités d’enzyme dans un mélange réactionnel final de 200 µL. La totalité du mélange réactionnel a été déposé sur gel.

pSK360+XbaI+EcoRI 1Kb+ pSK360+HindIII+EcoRI pSK360+XbaI+PvuII 1Kb+

4,0 3,0 2,0 1,65 1,0 Taille kb

4,0 1,65

0,1 Taille

kb

De manière alternative à la digestion, nous avons également expérimenté l‟amplification des inserts par PCR. Le plasmide utilisé comme cible a été ajouté dans le mélange réactionnel d‟amplification à 0,004 ng.µL^-1 en concentration finale. Cependant les molécules de plasmide matrices ont été re-concentrées lors des étapes de clonage et génèrent un bruit de fond lors du clonage des constructions toxiques.

Lorsque aucune sélection positive n‟est apportée par l‟insert, la sélection des transformants est effectuée sur le gène de résistance porté par le vecteur. Des transformants ne possédant que le vecteur recircularisé ont cependant été obtenus (faux positifs). Les temps de digestion ont donc été augmentés pour diminuer le nombre de plasmides résiduels non digérés, et deux conditions de déphosphorylation ont été testées pour prévenir la recircularisation des plasmides digérés. Un protocole de déphosphorylation présenté en Annexe 4 (modifié de celui fourni par les fabricants) a été choisis. Lors de la transformation des produits de ligation vecteur traité : insert, un contrôle de la transformation du produit de ligation du vecteur traité seul a par ailleurs été systématiquement réalisé en parallèle pour évaluer le bruit de fond qu‟il constitue. La transformation des produits de ligation de vecteurs seuls digérés par deux enzymes non compatibles et déphosphorylés est généralement inférieure à 10^-7, avec une fréquence de transformation normalisée (TN) par mole d‟ADN inférieure à 10^-2.

3.1.3 Vérification d’une expression inductible

Le vecteur pMMB190 à faible nombre de copies par cellule (12 copies chez E. coli) (Frey et al., 1992; Morales et al., 1991) porte un promoteur dont l‟activité est régulée par la protéine LacI. Celle-ci est produite constitutivement par le gène lacI^q porté par le plasmide. Le gène lacZ présent en aval du promoteur nous a permis de vérifier le contrôle de l‟expression du système régulateur porté par ce vecteur dans E. coli DH5. L‟alpha complémentation avec le gène lacZΔM15 présent dans E. coli DH5 permet la production d‟une enzyme, la - galactosidase qui en clivant le X-gal entraîne une coloration bleue visible à l‟œil nu. Après transformation de pMMB190 dans E. coli DH5, les transformants obtenus sont étalés sur milieu contenant du X-gal avec ou sans inducteur. Une coloration bleue des colonies est observée uniquement en présence d‟IPTG pour DH5 (pMMB190), confirmant l‟activation de l‟expression des gènes sous contrôle du promoteur PtaclacUV5 uniquement en présence d‟IPTG.

Sans inducteur Avec inducteur

(1)

(2)

(3)

(A) (B) (A) (B)

Figure 6 : Contrôle de l’expression exercé par différentes constructions génétiques Les souches E. coli JM109 contenant le plasmide (1) pJBA25 (2) pB24G (3) pB33G ont été étalées sur milieu gélosé sélectif contenant ou non l’inducteur de l’expression du gène gfp.

Les colonies sont observées sous microscope (A) sans filtre (B) avec le filtre GFP. Les photos ont été prises avec l’appareil photo digital AxioCam MRC5.

Un test similaire a été effectué pour des vecteurs portant le promoteur P_bad et le gène araC, responsable de la régulation de son expression. Le gène marqueur gfp a été cloné en aval du promoteur Pbad dans pBAD24 et pBAD33, vecteurs à respectivement moyen et plus faible nombre de copies par cellule (Guzman et al., 1995). Le contrôle de l‟expression des deux plasmides construits, respectivement pB24G et pB33G, a été testé par étalement des souches E. coli JM109 (pB24G) et JM109 (pB33G) sur milieu contenant ou non de l‟arabinose, inducteur de l‟expression. L‟expression de la protéine GFP (green fluorescent protein) est visualisée sous microscope équipé d‟un filtre GFP par l‟émission d‟une fluorescence (_émission= 510nm) après excitation de la protéine GFP (_excitation= 488nm). En absence d‟arabinose, aucune cellule verte n‟a été observée. En présence d‟arabinose, les cellules bactériennes contenant pB24G apparaissent vertes, celles contenant pB33G ne le sont pas (Figure 6). Les conditions d‟induction utilisées permettent donc une expression forte de la protéine GFP en présence d‟arabinose chez pBAD24. Dans le vecteur pBAD33, la quantité de protéines exprimées en présence d‟arabinose semble insuffisante pour être détectée avec le matériel de microscopie dont nous disposons. Le bon fonctionnement du système de régulation de l‟expression de pBAD33 a néanmoins pu être vérifié ultérieurement lors du clonage du gène colE3 (voir ci-dessous). La même cassette gfp a été clonée dans pBAD24 et pBAD33, la différence majeure entre pBAD33 et pBAD24 tient dans leur réplicon (respectivement p15A et pMB1). La plus faible quantité de protéine GFP exprimée par pB33G pourrait donc être expliquée par son plus faible nombre de copies par cellule. Pour la suite des clonages, pBAD33 a donc été préférentiellement utilisé.