CHAPITRE I Synthèse bibliographique
3.1 Développement d‟une méthode pour la détection de souches
Pour détecter des bactéries telluriques capables d‟acquérir de l‟ADN par électrotransformation, des cellules extraites du sol sont électroporées en présence de pSM1885. Ce plasmide possède deux gènes de résistance aux antibiotiques streptomycine (smr) et tétracycline (tcr) pour sélectionner les bactéries ayant acquis le plasmide. Néanmoins, les souches environnementales peuvent présenter la résistance à de multiples antibiotiques (Demaneche et al., 2001c). Pour différencier les vrais électrotransformants des bactéries naturellement résistantes, le gène marqueur gfp est utilisé. Ce gène porté par le plasmide pSM1885 exprime constitutivement la protéine GFP (green fluorescent protein) qui, sous la longueur d‟onde d‟excitation excitation= 488 nm, émet un rayonnement de longueur d‟onde
émission= 510 nm. Les bactéries produisant la protéine GFP apparaissent alors vertes.
Tableau 13 : Comparaison des estimations des densités bactérienne d’une culture bactérienne suivant la méthode de dénombrement utilisée
a Mode 1 : dénombrement suite à l’étalement de différentes dilution d’une suspension bactérienne sur boite de pétri contenant un milieu nutritif solide
b Mode 2 : dénombrement suite au mélange dune dilution donnée d’une suspension bactérienne avec un milieu nutritif en surfusion directement sur lame de microscope.
Dénombrement UFC.mL-1 Mode1a
UFC.mL-1
Mode2b Ecart type
1 6,01E+08 5,20E+08 5,73E+07
2 5,83E+08 5,80E+08 2,12E+06
3 1,37E+09 2,67E+09 9,19E+08
L‟utilisation de boîtes de Petri pour étaler les transformants est cependant peu adapté si un criblage ultérieur des colonies vertes est réalisé sous microscope à fluorescence.
Chacune des colonies pourrait être visualisée entre lame et lamelle au microscope, mais le criblage serait long et fastidieux. Aussi nous avons expérimenté une nouvelle méthode d‟étalement des bactéries, non plus sur boîte de Petri, mais directement sur lame de microscope. Un milieu gélosé serait déposé sur cette lame, dans lequel pourraient croître des colonies bactériennes. Des colonies bien inférieures en taille à celles se développant sur boîte pourraient être détectées, ce qui autoriserait la diminution des temps d‟incubation, l‟augmentation des densités bactériennes sans recouvrement entre colonies, la visualisation des colonies moins favorisées par la croissance sur milieu nutritif in vitro et le criblage de toutes les bactéries se développant sur milieu sélectif en une seule fois.
Une méthode d‟étalement sur lame a été testée et comparée avec celle sur boîte de Petri. Cent µL de la dilution 10-6 d‟une suspension d‟électrotransformants sont mélangés directement sur lame à 900 µL du milieu nutritif gélosé en surfusion sans pression de sélection. Parallèlement 100 µL des dilutions 10-4, 10-5 et 10-6 ont été étalés sur boîtes de Petri contenant du milieu agar sans pression de sélection. Le nombre d‟UFC.mL-1 ont été estimés après dénombrement des colonies. L‟expérience a été reproduite 3 fois. Le nombre d‟UFC.mL-1 calculé est cohérent entre les deux méthodes d‟étalement (Tableau 13). Un essai par ajout des cellules dans l‟agar en surfusion avant étalement sur lame s‟est révélé un peu moins concluant. Ce pré-mélange avant dépôt sur lame permettrait une meilleure homogénéisation des cellules dans le milieu nutritif. Une diminution du nombre d‟UFC.mL-1 de 5.108 à 108 a cependant été constatée. L‟expérience n‟a été reproduite qu‟une seule fois, le mélange sur lame a néanmoins été préféré pour la suite des expérimentations.
La méthode de dénombrement des colonies sur lame ayant été validée, des premiers essais d‟électrotransformation de pSM1885 ont été conduits avec une souche pure. L‟objectif de ces expériences est d‟une part de contrôler l‟acquisition et la stabilisation du plasmide dans une souche environnementale, d‟autre part de vérifier que l‟expression du gène gfp est visualisable. Des espèces bactériennes présentes dans le sol sont naturellement fluorescentes, comme Pseudomonas fluorescens. Afin de vérifier que l‟expression du gène gfp peut être détectable dans de telles souches, les essais d‟électrotransformation de pSM1885 ont donc été réalisés avec la souche électrotransformable P. fluorescens N3 isolée par Cérémonie et al.
(2004). P. fluorescens N3 a été rendue électrocompétente par lavages, soumise au choc électrique en présence ou absence du plasmide, puis étalée sur milieu sélectif en présence ou absence d‟antibiotiques pour le dénombrement des transformants et des cellules réceptrices.
(1)
(2)
(3)
(A) (B)
Figure 13 : Intensité de fluorescence de P. fluorescens après acquisition de pSM1885 Pseudomonas fluorescens mis en présence (1) d’eau, (2) d’eau suivi d’un choc électrique, (3) de pSM1885 suivi d’un choc électrique, sont étalées sur TSA en absence (1, 2) ou en présence (3) des pressions de sélection adéquates, puis incubées 48 heures à 30°C. Les colonies sont observées sous microscope (A) sans filtre (B) avec filtre GFP
Seules les cellules de Pseudomonas fluorescens N3 ayant acquis le plasmide se développent sur milieu sélectif, le plasmide pSM1885 peut donc se répliquer dans la souche testée. La fréquence d‟acquisition du plasmide in vitro est de 1,5.10-4, soit une fréquence 10 fois plus faible que celle décrite par Ceremonie et al. (2004). Suite à l‟observation des lames sous la longueur d‟onde d‟excitation de la GFP, une différence d‟intensité de fluorescence est constatée entre les bactéries soumises au choc électrique et les bactéries ayant acquis pSM1885 (Figure 13). Un gain de fluorescence est notamment observé pour les électrotransformants se développant sur milieu sélectif. Une surexpression de la fluorescence dans des souches naturellement fluorescentes est donc visuellement détectable.
Des essais d‟électrotransformation de pSM1885 ont été conduits dans des cellules environnementales extraites sur gradient de Nycodenz. Les cellules ont été mises en présence de pSM1885, un choc électrique a été appliqué, puis les cellules ont été étalées sur lame par mélange avec du TSA en surfusion. De la DNAase a été ajoutée après électroporation pour éviter toute acquisition du plasmide par transformation naturelle, et ainsi ne sélectionner que les bactéries ayant acquis l‟ADN par électrotransformation. Des témoins négatifs correspondant aux cellules environnementales seules (sans ajout d‟ADN) soumises ou non à un choc électrique ont également été effectués pour vérifier la présence de bactéries naturellement résistantes aux antibiotiques. Après incubation des lames, des bactéries naturellement résistantes ont été détectées : des cellules environnementales sont capables de se développer en présence des deux antibiotiques tétracycline et streptomycine, bien qu‟aucun plasmide n‟ait été introduit. Ces colonies sont plus nombreuses si un choc électrique a eu lieu.
Le choc électrique semble ainsi favoriser le développement d‟une résistance aux deux antibiotiques chez les bactéries extraites du sol. Toutefois, le plus grand nombre de bactéries se développant sur milieu sélectif est observé pour les cellules ayant été mises en présence du plasmide avant choc électrique. Suite à l‟observation des électrotransformants croissant sur milieu sélectif sous microscope équipé d‟un filtre GFP, différentes intensités de fluorescence sont constatées suivant les colonies. Plusieurs questions se posent quant à ces différentes intensités de fluorescence : sont–elles dues à la fluorescence naturelle des bactéries ou à l‟acquisition du plasmide ? Quelle sera l‟intensité de fluorescence des colonies des bactéries ayant acquis le plasmide et non naturellement fluorescentes ? Qu‟en est–il des bactéries exprimant faiblement la protéine GFP ? Un seuil d‟intensité de fluorescence permettant la discrimination entre vrais électrotransformants et cellules naturellement fluorescentes est nécessaire. La définition de ce seuil nécessiterait des expérimentations complémentaires avec des souches pures électrotransformables non naturellement fluorescentes.
Tableau 14 : Efficacité de la cassette toxique de pFEB98 chez différentes espèces bactériennes
Espèces bactériennes Concentrations en IPTG (µg.mL-1)
250 500 1000
E. coli DH5 (pFEB98) 5.10-7 5.10-7 9.10-70
A. baylyi BD413 (pFEB98) 10-5 5.10-6 NDa
P. fluorescens N3 (pFEB98) 100 100 100
L’efficacité de pFEB98 chez différentes espèces bactériennes est estimée par le calcul d’un taux d’échappement après induction par l’IPTG.
a ND : non déterminé
3.2 Efficacité de gènes toxiques dans différentes souches