La correction, l’analyse des images et le calcul d’une reconstruction 3D

molécule dans différents environnements biochimiques ce qui permet l’observation de différents états fonctionnels. (Ranson et al., 2006).

Comme je l’ai déjà mentionné plus haut, la prise d’images en MET est réalisée en mode faible dose pour limiter les dommages dus aux radiations dans les images. Les images sont réalisées par paire focale sur des négatifs ou à l’aide d’une caméra CCD. Chaque zone est photographiée deux fois à deux valeurs différentes de défocalisation afin de compenser la perte d’informations liée à la CTF. Après développement, les négatifs sont scannés puis soumis à une méthode d’analyse d’images afin de reconstituer un modèle 3D de la particule observée dans le MET.

La numérisation des négatifs est réalisée à l’aide d’un scanner dédié à la digitalisation des négatifs provenant de la ME. En effet, celui-ci possède des spécifications particulières. Le pas utilisé pour la numérisation est très faible (jusqu’à 7 μm) afin de conserver les informations à haute résolution contenue dans les images. De plus, le scanner ne modifie pas ou peu la CTF des images.

Les aberrations introduites par la numérisation sont les plus faibles possibles.

celles dédiées aux particules possédant une symétrie (Frank, 1981; Frank & van Heel, 1982; Frank et al., 1981; van Heel et al., 1996). Ces méthodes sont basées sur une reconstruction 3D dans l’espace réel, par épandage des images selon la 3^ème dimension (Frank, 1981; Frank et al., 1996). Une partie du traitement informatique restant tout de même commune aux différentes méthodes, je vais décrire dans la suite de mon exposé le principe général de l’obtention d’une structure 3D en MET et les traitements informatiques communs.

Le travail d’analyse d’images commence toujours par un tri manuel des micrographies. Cette sélection est basée sur l’absence d’astigmatisme et de dérive dans l’image, aberrations qui détériorent énormément la qualité de la future reconstruction ainsi que sur la valeur de la défocalisation à laquelle l’image a été enregistrée. Seule une gamme restreinte de défocalisation est exploitable (1 < Δf

< 3 μm). En dessous de 1 μm, le contraste est trop faible et l’orientation des particules n’est pas déterminable. Au dessus de 3 μm de défocalisation, le premier zéro de la CTF se situe dans une zone de basses fréquences ce qui altère une trop grande partie de l’information pour obtenir une reconstruction 3D de qualité. De plus le nombre de zéros de la CTF va fortement augmenter.

L’atténuation des hautes fréquences causée par la CTF sera très importante et va fortement diminuer la résolution de l’image. Les images en MET sont souvent enregistrées sur des négatifs. Il est donc nécessaire de numériser les micrographies à l’aide d’un scanner spécifique avant de procéder à un traitement. Ce scanner dispose d’un pas de numérisation très petit afin de ne pas détériorer la qualité des images (Zeiss Photoscan TD, pas de numérisation ≥ 7 μm). Les MET récents possèdent maintenant des caméras CCD permettant l’enregistrement numérique direct de la micrographie. Par la suite, les particules, pour chaque micrographie exploitable, doivent être sélectionnées et extraites de l’image de départ dans un nouveau fichier informatique. Ces nouveaux fichiers seront utilisés au cours du processus d’analyse d’images, sans jamais revenir à la micrographie de départ sauf au cours du travail de recentrage des particules (cf. Matériel et Méthodes). L’étape suivante, primordiale pour l’obtention d’une reconstruction 3D de qualité est la correction des aberrations liées à la CTF.

Correction de la CTF. Cette étape essentielle est à réaliser pour chaque micrographie. La méthode que nous avons utilisée pour corriger la CTF dans les images a été développé par James Conway et Alistair Steven (Conway & Steven, 1999). Elle consiste en deux traitements distincts réalisés sur les particules extraites après sélection. Mais avant de corriger les images, il faut avoir accès à la CTF de chaque image. Pour cela, le programme SUMPS permet de calculer le spectre de puissance moyen sur un jeu de particules données (Figure 18a) (Conway & Steven, 1999). Le

valeurs d’amplitude de la moyenne radiale du spectre de puissance en fonction des fréquences spatiales dans l’image permet de visualiser la CTF (Figure 18b).

La CTF est responsable de deux types de défauts qui peuvent être corrigés. Ces défauts sont visibles sur la Figure 19b. Le premier concerne les inversions de phase après chaque passage en zéro.

On recherche à quelles fréquences spatiales la CTF passe en zéro pour réaliser une inversion de phase dans les zones où le contraste est inversé. Ce premier traitement permet de restaurer une partie de l’information dans l’image.

Figure 18: Modélisation de la CTF à partir du spectre de puissance.

(a) Spectre de puissance moyen de l’image. On remarque une alternance de cercles concentriques clairs et sombres. (b) Moyenne radiale de la CTF brute d’une image et en rouge la gaussienne calculée qui passe par les zéros de la CTF. Le premier zéro de la CTF est visible à 0,05 = 1/20 Å (c) CTF après déconvolution par la gaussienne.

Les images traitées sont dites « flippées » (Figure 19a). Si on regarde la CTF des images

« flippées », on ne remarque pas une énorme différence avec la CTF brute. En effet ce traitement agit sur la phase ce qui n’entraîne pas de modifications majeures au niveau des amplitudes de la CTF.

L’atténuation des hautes fréquences est toujours présente (Figure 19a). Cet amortissement dans les hautes fréquences doit être corrigé, il s’agit là du deuxième défaut. Pour cela la CTF expérimentale propre à chaque image est modélisée comme en Figure 18b. Cette représentation est utilisée pour déterminer les paramètres m1, m2, m3 et m4 de la gaussienne responsable de l’atténuation qui se

traduit mathématiquement par :

( )

⎟⎟⎠

⎜⎜ ⎞

⎝

⎛− − +

= ₂

4 2 3 0 2

1 exp

m m m m

m

y . Cette gaussienne est déterminée au

niveau des zéros de la CTF (en rouge sur la Figure 18b) Une simple déconvolution permet ensuite de s’abolir des effets néfastes de la CTF (Figure 18c et Figure 19b). La déconvolution inclut aussi une inversion des phases comme dans le premier traitement et exclut les zéros.

Figure 19: Modélisation des moyennes radiales de la CTF après correction.

(a) Moyenne radiale de la CTF après inversion des phases : On ne voit que très peu de différences avec la moyenne radiale de la CTF « brute » (Figure 18b) car la correction a seulement lieu sur les phases sans toucher aux amplitudes. (b) Moyenne radiale de la CTF après déconvolution complète jusqu’à 9 Å de résolution, il n’y a plus d’information au-delà.

Les images traitées sont dites « déconvoluées ». On peut donc voir les effets de déconvolution sur la Figure 19b. L’atténuation des hautes fréquences est corrigée mais celle-ci n’est pas parfaite. Ces corrections introduisent beaucoup de bruits dans les images (notamment au niveau des zéros), il va donc falloir moyenner plus d’images par la suite dans le processus de reconstruction 3D pour avoir un rapport signal sur bruit équivalent à celui des images brutes. La correction de la CTF n’est réalisée que jusqu’à une valeur de résolution donnée par l’expérimentateur. Au delà de la résolution choisie (1/9 Å), on peut voir sur les figures 18b et 18c que l’image ne contient plus du tout d’information.

Ces corrections permettent tout de même de restaurer une grande partie de l’information dans l’image. Les nouvelles images vont donc être utilisées séparément en deux jeux, un jeu d’images

« flippées » l’autre d’images « déconvoluées ». Les images « flippées » vont servir à rechercher les orientations et le centre des particules car elles sont moins bruitées alors que les images

« déconvoluées » vont être utilisées pour la reconstruction 3D (Figure 20).

Analyse des images. Le traitement des images est composé de deux étapes majeures, résumées dans la Figure 20. Quelque soit le type de symétrie de la particule, l’image observée sur la micrographie d’un échantillon « congelé-hydraté » est toujours la projection 2D de l’objet. L’enjeu dans un premier temps est de déterminer l’orientation initiale selon laquelle l’objet a été projeté. Le centre de la particule est aussi un paramètre important à déterminer et à affiner. Le référentiel dans lequel sont définies les orientations et les coordonnées des centres dépend des conventions

implémentées dans le programme utilisé. Je détaillerai ces conventions plus loin dans mon exposé (cf. Matériel et méthodes).

La première étape du travail informatique utilise le jeu de particules dites « flippées » car ce jeu d’images contient plus d’informations que la micrographie de départ, les zones de contraste inverse dans l’image étant restaurées par inversion de phase. De plus, ces images possèdent un rapport signal sur bruit beaucoup plus important que le jeu d’images « déconvoluées ».

Dans la deuxième étape, les paramètres de centre et d’orientation précédemment définis pour chaque particule sont utilisés pour reconstituer le modèle en 3D de la particule étudiée (Figure 20).

Le principe de reconstruction 3D est basé sur un processus itératif d’affinement. La recherche des orientations et le calcul d’une reconstruction 3D sont réalisés en boucle jusqu'à obtention d’une reconstruction finale à la résolution la plus haute possible. Pour cela, le modèle 3D néo calculé va être projeté selon un pas angulaire connu et défini par l’expérimentateur. Les reprojections du modèle possèdent par définition une orientation connue qui est utilisée par comparaison avec les images de départ pour affiner les paramètres d’orientations (Figure 20). Je détaillerais l’obtention du modèle dans une partie de mon manuscrit (cf. II.2.2, Partie 2).

Malgré les progrès réalisés dans les trente dernières années, une reconstruction 3D en MET ne permet que rarement d’avoir des informations structurales à l’échelle atomique sur l’objet que l’on étudie. La ME, de part la longueur onde du rayonnement utilisé, devrait permettre d’atteindre une résolution atomique mais les aberrations et déformations que subit l’image sont encore trop importantes pour donner des données structurales à l’échelle atomique. Les récents développements de la ME concernant la correction des aberrations ainsi que des programmes de corrections et d’analyse d’images permettent maintenant d’atteindre de hautes résolutions. Il est possible, au-delà de 7 Å de résolution, d’identifier clairement la position des hélices α comme récemment pour les modèles de la protéine GroEL, celui de la capside de l’Adénovirus de type 5, obtenus à 6 Å de résolution (Jiang & Ludtke, 2005; Saban et al., 2006) ainsi que pour un des virus de la famille des Reoviridae à 3.88 Å de résolution (Yu et al., 2008).

Figure 20: Principe général de l'analyse d'images en ME.

(a)Les particules sont sélectionnées et extraites à partir d’une micrographie. (b)La CTF est corrigée pour donner deux jeux d’images, « flippées » et « déconvoluées ». (3)Etape 1: Les orientations de projection des particules sont déterminées par comparaison avec les reprojections d’un modèle de départ à partir du jeu d’images « flippées ». (d)Etape 2: Le jeu d’images « déconvoluées » est utilisé pour réaliser une reconstruction 3D en utilisant les orientations déterminées dans l’étape 1 puis le modèle obtenu sert à améliorer la recherche des orientations en calculant ses reprojections selon un pas défini par l’expérimentateur. On s’abolit complètement du modèle de départ à partir de là.