Résultats et discussion

La CryoME A partir de 878 particules parmi un total de 2916, nous avons pu reconstituer un modèle 3D à 12 Å de résolution (FSC0,3) de la souche ts1 dérivée du HAdV-2 (Figure 51a). Le graphique correspondant des FSC se trouve en annexe 5.

Figure 51: Modèle 3D en CryoME à 12 Ã de la souche mutante du HAdV-2 : le ts1.

(a) Reconstruction 3D finale de la capside du mutant ts1 vue selon l’axe 2 de l’icosaèdre. (b) Vue transversale en coupe de la densité (réalisé avec SPIDER/JWEB). La barre d’échelle sur la figure b représente 100 nm.

On peut voir sur l’image en isosurface du virus ainsi que sur une coupe transversale que la densité est très détaillée (Figure 51). Un tel niveau de détails rend l’observation et l’analyse du modèle particulièrement difficile surtout sur une vue complète de la capside (Figure 51), c’est pourquoi j’ai réalisé un zoom sur une face en Figure 52. La capside du ts1 semble posséder les mêmes caractéristiques externes qu’une souche mature d’Adénovirus. Aucune différence majeure n’est observée au niveau des protéines majeures ni des protéines mineures. Les protéines majeures montrent un fort niveau de détails mais la structure et le positionnement global sont conservés chez le mutant ts1. Les structures de la Base du Penton et des Hexons sont en accord avec les précédentes reconstructions (Figure 52).

Figure 52: Zoom sur une face de la Reconstruction 3D du mutant HAdV-2 ts1.

Vue selon l’axe d’ordre 3 présent au centre de la face. Les Pentons sont représentés en bleu et les densités correspondantes aux extrémités N et C terminales de la protéine IX en jaune.

Les protéines mineures du coté externe de la capside ne montre pas non plus de différences majeures avec une souche mature d’Adénovirus (Figure 52). Nous n’observons pas d’extra densités chez le ts1 du coté externe de la capside pouvant être attribuées à une zone non maturée de la capside. La densité attribuée à l’extrémité N terminale de la protéine IX forme, de la même manière que dans une capside mature, quatre trimères au niveau des GONs. La partie C terminale est aussi présente au niveau de l’extérieur des GONs (en jaune sur la Figure 52). Les contacts réalisés par la protéine IX avec les Hexons adjacents semblent aussi conservés. La seule différence représentative est localisée au niveau de la partie externe du C terminale de la protéine IX. En effet, cette zone semble plus allongée chez le mutant ts1 (entourée sur la Figure 53). Cette différence est difficile à interpréter en raison de la résolution de la reconstruction ainsi que de l’utilisation d’un autre MET pour la prise d’images mais elle pourrait tout de même provenir d’une zone non maturée de la protéine. En effet, la taille du précurseur immature de la protéine IX est connue mais personne ne sait réellement

quelles parties sont incorporées dans la capside ni quelles zones subissent une maturation par la protéase virale.

Figure 53: Comparaison des densités attribuées à l'extrémité C terminale de la protéine IX.

(a) Densité attribuée à la partie C terminale de la protéine IX dans la reconstruction du HAdV-5 WT en rose (cf. Article 1). (b) Même densité dans la reconstruction du ts1, en rose. L’ellipse jaune marque la position d’un axe icosaédrique d’ordre 2. Le cercle montre la densité supplémentaire présente à l’extrémité la plus externe.

Dans l’ensemble, la maturation par la protéase virale ne semble pas affecter les contacts entre protéines ni avoir une grande influence sur la partie externe de la capside, étant donné le peu de différences observées par rapport à un virus mature. Ce n’est pas le cas de la partie interne de la capside (Figure 54).

Figure 54: Vue selon l’axe 5 de l’icosaèdre de la zone située en dessous des Pentons.

Densités supplémentaires chez le ts1 observées depuis l’intérieur du virus en vert. La protéine IIIa et la protéine VIII sont respectivement colorées en rouge et orange. Les numéros indiquent la présence de l’axe 5 de l’icosaèdre et marquent la répétition de cinq complexes identiques à celui présenté en couleurs.

En effet, la zone interne qui subit le plus de modifications se situe en dessous des Pentons.

Cette zone semble clairement affectée par l’absence de maturation par protéolyse. Des densités supplémentaires sont visibles au contact des protéines IIIa et VIII à l’intérieur de la capside par rapport à la capside du HAdV-5 (Figure 54). Même si une reconstruction de si haute résolution reste difficile à analyser, on peut remarquer la présence d’une densité de forme globulaire en contact avec une autre densité supplémentaire de forme plutôt triangulaire (en vert sur la Figure 54). La zone triangulaire vient se placer à l’interface entre la protéine IIIa et VIII alors que la partie plus globulaire

se situe plus vers l’intérieur de la capside uniquement attachée à la densité triangulaire. En absence de caractérisations biologiques, la taille des protéines IIIa et VIII dans une capside à l’état mature n’étant pas connue, il est difficile de conclure sur l’origine de ces densités surnuméraires mais plusieurs causes peuvent être à leur origine. L’équipe du Dr. Greber a montré la présence sous une forme inactive de la protéase virale à l’intérieur de la capside. Les densités observées pourraient soit correspondre à la présence de la protéase virale soit à des parties non maturées des protéines IIIa et VIII. Cette souche mutante de HAdV-2 échoue à sortir de l’endosome probablement parce que la protéase n’est pas capable de dégrader la protéine VI qui est responsable de l’activité lytique des membranes lors de la phase précoce d’infection. On s’attendrait, dans ces conditions, à trouver la protéase au voisinage de la protéine VI. La localisation de la protéine VI étant très controversée depuis la publication des travaux de Saban et al., 2006, il est difficile d’aller plus loin dans l’interprétation.

Le fitting Un modèle quasi-atomique a été calculé pour le mutant ts1. « Le fitting » en corps rigide a pu être réalisé avec le programme URO (Navaza et al., 2002) pour toutes les protéines majeures : les Hexons de l’UA et la Base du Penton. Les critères de qualité obtenus en dernière phase d’affinement sont, pour les Hexons de l’UA : CC= 88.9, R=38.2, Q=10.7 et pour la Base du Penton : CC=89.6, R=38.8, Q=10.0.

Figure 55 : Vue de dessus d’une UA du modèle quasi- atomique à travers la densité correspondante provenant de la reconstruction 3D du mutant ts1.

La structure cristallographique des Hexons 1 à 4 de l’UA sont colorés respectivement, en jaune, cyan, vert et rouge.

Les valeurs obtenues pour les différents paramètres d’évaluation de « fitting » sont très bonnes même si elles restent légèrement inférieures à celle obtenues pour le modèle quasi-atomique du HAdV-5. Le placement de la Base du Penton et des Hexons est réalisé de façon satisfaisante. Il

n’existe pas de différences majeures que ce soit au niveau de la position des protéines majeures ou au niveau de leur orientation entre le modèle quasi-atomique du mutant ts1 et celui du HAdV-5. On peut expliquer la légère diminution des critères de qualité par la résolution de la reconstruction 3D du ts1. Plus la résolution du modèle 3D obtenu en ME est élevée, plus la différence entre la structure cristallographique d’une protéine et ce modèle est marquée. Lorsqu’on observe un Hexon replacé au sein de la densité lui correspondant, on remarque que certaines zones riches en structures secondaires ne se placent pas parfaitement dans la densité. Il faudrait commencer à déformer la structure cristallographique des Hexons et de la Base du Penton par les techniques de « fitting » flexibles pour obtenir un meilleur accord avec la carte de ME. On peut aussi expliquer les résultats obtenus par l’utilisation de structures cristallographiques de protéines majeures maturées que l’on tente de replacer au sein de la carte obtenue à partir d’un virus immature. Le déplacement de certaines zones dans l’Hexon ou la Base du Penton peut être expliqué par l’absence de maturation de la capside du ts1. Dans notre étude, le modèle quasi-atomique du ts1 a surtout été utilisé pour calculer une carte de différence et éliminer la densité des protéines majeures dans le modèle 3D obtenu en MET facilitant ainsi l’observation et l’analyse de la capside du ts1.