Matériel et Méthodes

Grâce à une collaboration avec le Pr. Pierre Boulanger et le Dr. Manuel Rosa-Calatrava (IFR Laennec, Lyon), nous disposions tout d’abord d’un échantillon de HAdV-5 mutant à une concentration d’environ8×10¹²particules/ml. Ce virus noté HAdV-5_SY12 présente une modification au niveau de la protéine IX. En effet, un peptide de 12 acides aminés noté SY12 (TAYSSYMKGGKF) est fusionné à l’extrémité C terminale de la protéine IX sans peptide de liaison.

Après expression et purification, la solution virale est conservée à - 80°C dans un tampon PBS 1x contenant 10% de glycérol. Nous disposions, de plus, d’un lot d’anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre le peptide SY12. Ces anticorps ont été récoltés dans le sérum d’un lapin après 87 jours post-injection et purifiés sur une colonne d’affinité contre le peptide SY12 lui-même. Après 87 jours post-infection, le sérum est essentiellement constitué d’Immunoglobulines de type G (Ig G).

La connaissance du type d’anticorps ainsi que de l’espèce de l’animal duquel ils proviennent est importante pour la mise au point d’un protocole de purification adapté. Leur spécificité pour le peptide SY12 a été vérifiée par Western Blot. La solution d’anticorps à une concentration de 0,8 mg/ml est conservée à -20 °C dans un tampon PBS 1x contenant 0,1% p/v SAB ainsi que du thimerosal. Le thimerosal est une molécule cyclique utilisée comme agent de conservation des anticorps. Sa forte absorbance dans l’UV nous oblige à utiliser la méthode de Bradford pour la mesure des concentrations protéiques.

Figure 45: Principe de coupure d'un anticorps à la papaïne.

Le clivage enzymatique à la papaïne permet de séparer l’anticorps en 2 fragments Fab et 1 fragment Fc.

La double flèche noire représente le site de coupure de la papaïne. Les domaines entourés en vert appartiennent à la chaîne lourde, ceux en orange constituent la chaîne légère. Les domaines marqués en gris correspondent aux domaines constants et ceux en marron clair aux domaines variables des chaînes lourdes et légères. Le trait rouge représente la zone de liaison à la protéine A au niveau de la partie Fc.

Un anticorps est une molécule de l’immunité acquise ou adaptative, utilisée pour détecter et neutraliser les agents pathogènes. Les anticorps sont secrétés par une cellule dérivée des lymphocytes B, les plasmocytes après exposition à un antigène quelconque. Ces molécules sont des glycoprotéines de la superfamille des immunoglobulines formées de 4 chaînes polypeptidiques (150 kDa environ): 2 chaînes lourdes (50 kDa environ chacune) et 2 chaînes légères (25 kDa environ chacune) qui sont reliées entre elles par un nombre variable de ponts disulfures intra et inter-chaînes (S_S sur la Figure 45) assurant ainsi une rigidité à la molécule. Un anticorps possède trois extrémités, deux Fab responsables de la liaison avec l’antigène ainsi qu’une extrémité Fc constante qui relie les deux Fab (Figure 45). Les deux extrémités capables d’interagir avec l’antigène étant reliées, l’attachement d’un anticorps à son antigène entraîne souvent une agrégation de l’antigène par pontage via les molécules d’anticorps. Pour réaliser une étude structurale en MET, il est nécessaire d’empêcher ce pontage.

Pour cela, une des solutions est d’individualiser les domaines Fab par digestion enzymatique à la papaïne (Figure 45). Les Fab obtenus sont, par la suite, purifiés et séparés du reste des fragments

(anticorps non digérés, fragments Fc et SAB) avant de réaliser un complexe avec le virus. Je vais donc détailler dans les parties suivantes le protocole de digestion des anticorps et de purification des fragments Fab puis la réalisation d’un complexe entre le virus entier et les fragments Fab purifiés.

Enfin je présenterai les résultats que nous avons obtenu à l’issu de l’analyse d’images en MET concernant la localisation de l’extrémité C terminale de la protéine IX chez le HAdV-5.

V. 1.2 Préparation et Purification des Fab

Tous les tubes et concentrateurs utilisés pour la manipulation des anticorps sont préalablement incubés une nuit à 4° C avec une solution de passivation (1% Lait écrémé dans du PBS 1X) afin d’éviter l’interaction non spécifique des anticorps avec le plastique des tubes. Le principe de purification des Ig G de lapin est basé sur la propriété de la protéine A à fixer les extrémités Fc des Ig G avec une bonne affinité (entre 8 et 15 mg d’Ig G par ml de gel de protéine A).

Colonne d’affinité à la protéine A. Cette étape est réalisée à l’aide du Nab Protein A plus spin kit (Pierce), conformément au protocole. Un volume de 700 μl d’anticorps purifié est incubé 1h à température ambiante, sous agitation, avec 150 μl de résine protéine A. La résine est lavée avec 3 volumes colonne de PBS 1x puis l’anticorps est élué de la résine avec 3 volumes colonnes de tampon d’élution (fourni dans le kit). L’acidité du tampon d’élution est neutralisée à l’aide d’une solution de 1 M Tris pH 8. La solution d’anticorps est ensuite concentrée à l’aide d’un concentrateur vivaspin2 (Vivascience) possédant une membrane Hydrosart (c/o = 30 kDa). Cette étape permet d’éliminer une grande partie de la SAB et du thimerosal qui contamine fortement l’échantillon. Lors de cette première étape de purification, l’anticorps est retenu sur la résine alors que la SAB et le thimérosal passent directement dans le tampon de lavage de la résine.

Digestion à la papaïne. Cette digestion est réalisée par de la papaïne immobilisée sur des billes d’agarose (Pierce) avec un rapport E:S de 10:1 en quantité conformément au protocole fourni.

L’anticorps est incubé avec le gel de papaïne sous agitation à 37 °C pendant 12h. L’arrêt de la réaction est réalisé sur glace avec 1 volume de tampon de lavage 10 mM tris pH 7,5 puis le gel est rincé avec 1 volume équivalent de tampon de lavage.

Colonne d’affinité à la protéine A. Cette étape est aussi réalisée à l’aide du Nab Protein A plus spin kit conformément au protocole. La résine est incubée 2h à température ambiante sous agitation avec la solution d’anticorps. Les fragments Fab sont récupérés au lavage de la résine et les fragments Fc ainsi que les anticorps partiellement ou non digérés sont élués conformément au protocole. La

solution récupérée après lavage contenant les fragments Fab est enfin concentrée à l’aide d’un concentrateur Vivaspin2 Hydrosart (c/o = 30 kDa) et la concentration protéique est mesurée avec la méthode de Bradford.

V. 1.3 Préparation des complexes Virus – Fab

Une aliquote de 50 μl de virus HAdV-5_SY12 est décongelé puis le glycérol est éliminé par centrifugation sur une unité Microbiospin6 (Biorad) conformément au protocole fourni. Le virus est ensuite incubé pendant 2h à température ambiante, sans agitation, avec la solution de Fab précédemment préparée à un ratio molaire de protéine IX:Fab de 1:10. La présence d’anticorps à la surface du virus HAdV-5_SY12 est vérifiée par observation en MET par la méthode de coloration négative dans 2% AmMb.

V. 1.4 CryoME

Nous avons étudié un échantillon de virus HAdV-5_SY12 seul comme contrôle puis en complexe avec le Fab purifié anti-SY12. Dans les deux cas, les images ont été réalisées par le Dr. Guy Schoehn sur le Microscope JEOL 2010F de l’IBS à un grandissement nominal de 30 000 fois. Les images sélectionnées ont été scannées avec un pas de 7 μm sur le scanner ZEISS de l’IBS. Cela correspond à une taille calibrée de pixel de 2,3 Å. Pour le traitement des images, les particules ont été sélectionnées manuellement dans X3D à l’aide d’une sélection carrée de 447 pixels de coté. Comme pour les traitements des images du HAdV-5 WT, la recherche des orientations et des centres a été réalisée avec PFT puis PFT2 à partir de la reconstruction 3D à 10 Å de résolution du HAdV-5. La reconstruction 3D est calculée avec EM3DR puis EM3DR2. La CTF des images a été inversées jusqu’à 15 Å et déconvoluées à 8 Å pour l’échantillon contrôle. Pour l’échantillon en complexe avec le Fab, les images ont été inversées jusqu’à 15 Å de résolution pour la recherche des orientations et déconvoluées à 8 Å pour réaliser une reconstruction 3D.