Démonstration de l’utilité des mycoplasmes fluorescents pour l’étude des interactions

106 Table 11 : Sites d'insertion du transposon dans les différentes souches mutantes fluorescentes chez Mmm et M. bovis. Les sites d’insertion du transposon dans le génome des souches PG1 (n° Genbank BX293980.2) de Mmm ou PG45 (CP002188) de M. bovis sont décrits par leurs annotations respectives. Nd ; non déterminé.

II.5 Démonstration de l’utilité des mycoplasmes fluorescents pour

107 Figure 26 : Microscopie confocale de macrophages bovins infectés durant 30 minutes avec des mycoplasmes fluorescents. La photographie du haut montre des macrophages infectés à une MOI de 200 avec le mutant N6 de Mmm souche Rita, exprimant mNeonGreen. Celle du bas, montre des cellules infectées dans les mêmes conditions mais avec le mutant N8 deM. bovis souche Oger2, exprimant aussi mNeonGreen. Les barres d’échelle sont à 20 µm.

Sur ces images, on peut bien distinguer les mycoplasmes marqués en vert à l’intérieur du macrophage, dont la membrane est délimitée par un marquage rouge. Les mycoplasmes se trouvent dans le même plan focal que le noyau, dont l’ADN est marqué en bleu, ce qui démontre leur localisation intracellulaire. Les mycoplasmes fluorescents sont bien visibles, qu’ils soient individualisés ou en agrégats.

L’analyse quantitative par cytométrie en flux des cellules phagocytaires infectées avec des mycoplasmes intracellulaires est présentée en figure 27. Sur cette figure, on peut voir que l’intensité de fluorescence basale des macrophages est augmentée lorsqu’ils sont

108 infectés par les souches sauvages de mycoplasmes testés. Cette intensité varie selon l’espèce qui les infecte. En effet, ils sont plus auto-fluorescents après une infection par M.

bovis que par Mmm (MFI de 7150 comparée à 2600 respectivement). L’infection de ces macrophages avec les souches fluorescentes permet une bonne discrimination par rapport aux infections par les souches sauvages. Les MFI sont ainsi multipliées par 10 pour une infection par M. bovis et par 4 pour une infection par Mmm. Le pourcentage de macrophages qui contiennent du mycoplasme fluorescent intracellulaire détectable par cette technique est de 96% pour ceux infectés avec M. bovis et 84% pour Mmm.

109 Figure 27 : Analyse de macrophages bovins infectés par des mycoplasmes fluorescents en cytométrie en flux. Les macrophages bovins (MΦ) ont été infectés durant 30 minutes avec M. bovis ou Mmm ; souche sauvage (WT) ou exprimant mNeonGreen. La colonne de gauche reflète la morphologie de la population (FSC vs SSC) et celle de droite un histogramme quantitatif du nombre

de macrophages en fonction de l’intensité de fluorescence.

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III Conclusions et perspectives

Nous avons ici développé un nouvel outil permettant de faire exprimer de façon constitutive des protéines fluorescentes chez les mycoplasmes. Cet outil a, dans un premier temps, été développé pour une expression optimale chez Mmm mais nous avons montré sa versatilité en démontrant son efficacité chez M. bovis. En effet, malgré l’éloignement phylogénétique de ces deux espèces (Sirand-Pugnet et al., 2007) le système d’expression fonctionne très bien chez chacune d’entre elles où trois protéines fluorescentes ont été exprimées avec succès. Des colonies fluorescentes rouges et vertes ont ainsi été observées par microscopie de fluorescence. De plus, nous n’avons pas observé de toxicité, ni de retard de croissance ou de différence phénotypique chez les mutants fluorescents.

Avant la réalisation de ce travail de thèse, hormis quelques outils d’expression développés avec de nombreuses limitations (Balish et al., 2003; Kenri et al., 2004; Tulum et al., 2014; Zimmerman and Herrmann, 2005), aucun outil aussi performant n’avait été décrit pour le marquage par fluorescence des mycoplasmes entiers. Aucun ne permettait d’observer directement sur milieu gélosé des colonies de mycoplasmes fluorescentes.

Depuis, un système de marquage intrinsèque de M. hyopneumoniae avec la GFP permettant la visualisation de colonies vertes par microscopie de fluorescence a été décrit (Ishag et al., 2016). Dans ce travail d’Ishag et ses collaborateurs, le gène de la GFP (non optimisé) a été exprimé sous contrôle du promoteur de la P97 (adhésine principale de cette espèce) à partir d’un plasmide réplicatif oriC. Les colonies de transformants présentent une intensité de fluorescence très remarquable, particulièrement pour un pathogène fastidieux comme celui- ci. Ce résultat est assez surprenant aussi en vue de l’échec des études précédentes utilisant la GFP (Duret et al., 2003) et de nos résultats, plutôt décevants pour la GFP2. De plus, le système développé reste limité à l’utilisation chez M. hyopneumoniae, du fait de la spécificité de l’origine de réplication, tandis que nos constructions peuvent être utilisées chez diverses espèces de mycoplasmes.

Nous avons attribué le succès de notre approche principalement au choix de protéines fluorescentes permettant une expression suffisante de la fluorescence chez les mycoplasmes. En effet, la GFP, qui est la protéine fluorescente la plus couramment utilisée, n’est pas celle qui a donné les meilleurs résultats ici, et ce même après optimisation de la séquence de son gène pour l’usage préférentiel des codons des mycoplasmes. En même

111 temps, bien que l’expression de la GFP2 n’ait pas été satisfaisante en termes d’intensité de fluorescence, aucune toxicité ou instabilité n’a été détectée chez ces mutants.

De façon intéressante, les gènes optimisées des protéines mNeonGreen, mKO2 et mCherry ont très bien fonctionné chez M. bovis, confirmant, entre autre, la versatilité du promoteur tufA de Mmm utilisé pour contrôler l’expression de ces gènes. L’optimisation des gènes hétérologues a été faite pour maximiser le rendement lors de la transcription afin que les séquences des protéines fluorescentes ne soient pas reconnues comme étrangères. Nous n’avons pas essayé de transformer les souches avec les séquences correspondantes aux gènes des protéines fluorescentes non optimisées, mais si on se fie à la littérature, il semblerait que les meilleurs résultats aient été obtenus après optimisation selon le code génétique des mycoplasmes (Tulum et al., 2014)

Le système que nous avons développé ici devrait être largement utilisable chez beaucoup d’espèces de mycoplasmes. La majeure limitation à cet outil est le fait que le gène aacA-aphD conférant la résistance antibiotique utilisée dans notre modèle ne peut pas s’appliquer à certains mycoplasmes qui sont, eux, naturellement résistants. C’est le cas notamment de M. penetrans et M. fermentans (Renaudin et al., 2014). Quant à M.

genitalium, sa croissance est perturbée lors de l’expression du gène de résistance. Pour ces mycoplasmes, il faudrait donc remplacer le gène aacA-aphD par un autre plus adapté au modèle comme le gène de la chloramphénicol acetyl-transferase (cat) ou le gène de résistance à la tétracycline (tetM). Ces deux gènes de résistance ont déjà été utilisés et fonctionnent chez ces mycoplasmes (Renaudin et al., 2014). D’autres Mollicutes n’utilisent pas le codon UGA pour le tryptophane, ce qui est incompatible avec l’utilisation du transposon, qui porte un codon UGA-tryptophane dans le gène de la transposasse tnpA. Il faudrait donc faire de la mutagénèse dirigée pour pouvoir utiliser notre système chez ces espèces.

Des mycoplasmes intrinsèquement fluorescents ont été développés. De plus, le niveau d’expression est tel qu’il permet aussi (et c’est le but recherché) d’étudier les mycoplasmes en interaction directe avec les cellules de l’hôte. Ainsi, le développement de ces systèmes d’expression de gènes fluorescents et leur validation pour le suivi des interactions des mycoplasmes avec les cellules hôtes ont fait l’objet d’une publication («

Development of fluorescence expression tools to study host-mycoplasma interactions and validation in two distant mycoplasma clades ». J Biotechnol. 2016 Aug 4;236:35-44. doi:

112 10.1016). Le système d’expression de gènes fluorescents que nous avons développé ouvre donc une multitude de perspectives pour le suivi direct des mycoplasmes, notamment dans le cadre des études d’interaction entre les mycoplasmes et leur hôte, que ce soit in vivo ou in vitro. En effet, la possibilité d’éliminer la résistance antibiotique des mutants fluorescents est très intéressante pour d’éventuelles applications in vivo. L’application de ces outils à l’étude des interactions des mycoplasmes avec les cellules de l’hôte in vitro sera détaillée dans le chapitre suivant.

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Chapitre 3