Etude de la survie des mycoplasmes en présence de macrophages dérivés de

II.1.1 Evaluation de la cytométrie en flux pour l’analyse de la cinétique d’infection des macrophages par les mycoplasmes

Dans le chapitre précédent nous avons démontré que les mycoplasmes fluorescents peuvent être utilisés avec succès dans les analyses d’interactions cellulaires. Nous avions

118 choisi d’utiliser les clones mNeonGreen N6 de Mmm Rita et N8 de M. bovis Oger2 afin de réaliser des infections in vitro de macrophages bovins dérivés des monocytes sanguins. Ces clones ont pu être identifiés à l’intérieur des cellules par cytométrie en flux et microscopie confocale à une forte MOI (200) et après 30 minutes de contact. Alors, nous avons voulu tester les limites de détection de ces méthodes pour évaluer leur champ d’application possible. Nous voulions notamment vérifier si nous pouvions utiliser la cytométrie en flux pour quantifier le pourcentage de macrophages infectés par les mycoplasmes. Cette technique faciliterait énormément les expériences de cinétique d’infection, classiquement basées sur le titrage d’UFC. En effet, la technique de titrage de mycoplasmes sur gélose est laborieuse et longue, puisqu’il faut attendre plusieurs jours avant de pouvoir compter les colonies. De plus, elle est peu reproductible quand il s’agit de bactéries agrégées ou associées aux cellules, qui sont difficilement individualisables. Finalement, elle doit être associée à des traitements antibiotiques efficaces pour permettre la quantification des mycoplasmes présents à l’intérieur des cellules par rapport à ceux qui se trouvent à l’extérieur (test de protection aux antibiotiques). Néanmoins, cette technique est très simple et permet d’avoir des résultats relativement quantitatifs.

Nous avons donc réalisé une cinétique d’infection des macrophages à 30 minutes et 18 et 72 heures. Pour cela, nous avons mis en contact des macrophages bovins et des mycoplasmes pendant 30 minutes, puis nous avons enlevé l’inoculum avec tous les mycoplasmes qui n’avaient pas adhéré ou étaient restés en suspension et remis du milieu de culture afin de poursuivre l’infection pour les analyses à 18 et 72 heures post-infection. A chaque point de la cinétique les puits ont été lavés afin de retirer tout ce qui était en suspension et nous avons récupéré les cellules par grattage avant analyse par cytométrie en flux et titrage classique sur gélose. Avant titrage, les cellules ont été passées au travers d’une aiguille 25G à l’aide d’une seringue pour lyser les cellules et homogénéiser les titrages. De plus, nous avons infecté les macrophages soit avec les souches sauvages, soit avec les mutants fluorescents de Mmm et M. bovis pour comparer leurs capacités d’invasion et persistance respectives.

Les résultats pour M. bovis en cytométrie en flux sont illustrés dans la figure 28. Des résultats similaires ont été obtenus pour Mmm (résultats non montrés). Les résultats des titrages correspondants sont retranscrits dans l’Annexe 5 et illustrés en Figure 29. Cette expérience nous a permis de montrer que le titrage était, dans ses conditions, beaucoup plus sensible que la cytométrie. En effet, la cytométrie après 18 et 72 heures d’infection ne

119 permet de détecter que peu (13%) ou pas du tout (0%) de cellules positives, alors que le titrage réalisé en parallèle donne un titre de 10⁵ UFC/mL. L’utilisation de la cytométrie en flux pour une étude de survie en cinétique ne semble pas adaptée à cause des limites de détection pas assez sensibles. En conséquence, la suite des analyses quantitatives se fera par titrage classique. De plus, nous avons vérifié que les résultats des titrages sont équivalents indépendamment de la présence de marqueurs fluorescents. En effet, les souches fluorescentes se comportent comme leurs souches sauvages respectives. Les souches sauvages et les mutants seront donc utilisés indistinctement dans les analyses suivantes.

Figure 28 : Analyse en cinétique de la présence de mycoplasmes associés aux macrophages bovins par cytométrie en flux. Les macrophages bovins (MΦ) ont été infectés durant 30 minutes avec M.

bovis souche sauvage (WT) ou exprimant mNeonGreen (N8) à une MOI 10000. L’inoculum a été alors retiré et l’incubation s’est poursuivie pendant 18 et 72 heures. Les macrophages ont été analysés après grattage du contenu des puits préalablement lavés à 30 minutes, 18 heures ou 72 heures post- infection (PI). La ligne du haut présente la morphologie de la population (FSC vs SSC) et celle du bas un histogramme quantitatif du nombre de macrophages en fonction de l’intensité de fluorescence.

MFI : médiane des intensités de fluorescence.

120 Figure 29 : Quantification de mycoplasmes vivants au cours du temps en présence de macrophages bovins. Les macrophages bovins (MΦ) ont été infectés durant 30 minutes avec M.

bovis Oger2 ou Mmm Rita souche sauvage (WT) ou exprimant mNeonGreen (N8 ou N6 respectivement) à une MOI de 10000 pour M. bovis et 1000 pour Mmm. L’inoculum a été alors retiré et l’incubation a poursuivie pendant 18 et 72 heures. Les titrages ont été réalisés après grattage du contenu des puits préalablement lavés à 30 minutes, 18 heures et 72 heures post-infection.

L’histogramme représente le titre moyen mesuré à différent temps post infection chez les souches fluorescentes et leurs souches sauvages respectives.

Pour pouvoir utiliser la cytométrie en flux en étant plus sensible, il faudrait optimiser les longueurs d’onde. Aucun laser disponible pour les cytomètre ne permet d’exciter de façon optimale mNeonGreen mais on peut jouer sur la longueur d’onde d’émission en utilisant des filtres plus adéquats dont nous ne disposons pas actuellement au laboratoire.

Lors de l’acquisition de la fluorescence en microscopie confocale, nous pouvons régler la longueur d’onde plus finement afin de récupérer plus de signal que sur le cytomètre ce qui peut expliquer en partie la différence de sensibilité. De plus les macrophages possèdent leur propre auto fluorescence qu’il est plus facile d’éliminer dans les réglages en microscopie qu’en cytométrie.

II.I.2 Effet dose sur la survie des mycoplasmes sous forme adhérée après lavage