Utilisation des mycoplasmes fluorescents pour déterminer l’adhérence aux cellules

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II.2 Utilisation des mycoplasmes fluorescents pour déterminer l’adhérence aux

142 Il est surprenant que par cytométrie en flux nous ne voyions pas de signal de fluorescence dans le cas d’infection avec M. bovis, alors que les résultats obtenus en microscopie sont sans appel. Il est fortement probable que les interactions entre les mycoplasmes et les cellules EBL aient été supprimées avec le traitement pour le décollage des cellules. Ceci limite l’application de la cytométrie en flux pour l’étude des interactions entre les mycoplasmes et les cellules fortement adhérentes.

Figure 40 : Microscopie confocale des cellules EBL infectées durant 2 heures avec des mycoplasmes fluorescents à une MOI de 200. Sont représentés de gauche à droite des cellules EBL non infectées puis infectés avec Mmm souche Rita N6 exprimant mNeonGreen puis avec M. bovis souche Oger2 N8 exprimant aussi mNeonGreen. Les images du hauts sont réalisées au bout de 4 heures post infection et celle du bas après 24 heures. Les noyaux sont marqués en bleu (Hoechst), les membranes sont marquées en rouge (CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain), les mycoplasmes sont marqués en vert (mNeonGreen) Les barres d’échelle sont à 20 μm. Grossissement X63.

Dans la littérature on trouve des données contradictoires en ce qui concerne l’adhérence de Mmm aux cellules épithéliales embryonnaires bovines de poumons. Dans une première étude les auteurs ont montré une très faible adhérence aux cellules primaires épithéliales embryonnaires bovines (Aye et al., 2015). Ces résultats sont en accord avec les résultats que nous avons obtenus et avec la pathogénie puisqu’une infection à Mmm n’entraine pas de symptômes chez les veaux infectés. D’autres auteurs ont, eux, mis en

143 évidence l’attachement de la souche Ben-1 aux EBL et ont proposé une protéine qui contribuerait à cette adhérence spécifique. Néanmoins, ces auteurs ne mettent pas en évidence le mycoplasme mais révèlent juste la présence d’antigène du mycoplasme par détection au microscope confocal après des marquages anticorps indirects (Zhou et al., 2016).

III Conclusions et perspectives :

Nous avons développé un outil performant capable de permettre la visualisation in vitro des interactions entre les mycoplasmes et les cellules de l’hôte.

Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux interactions entre les macrophages bovins et les mycoplasmes Mmm (souche Rita) et M. bovis (souche Oger2). Les résultats des travaux décrits dans ce chapitre permettent de mettre en évidence des comportements très différents entre les deux souches étudiées en ce qui concerne leur capacité de survie en présence de macrophages bovins. Ces résultats peuvent être représentatifs d’autre souches virulentes de Mmm, car il y a que très peu de polymorphisme intraspécifique alors que les résultats obtenus chez M. bovis sont certainement plus dépendants de la souche étudiée si l’on prend en considération la grande disparité observée dans d’autres études selon les isolats étudiés (Suleman et al., 2016).

Une première approche, basée sur la mesure du titre post infection avec ou sans lavages indique, aux MOI les plus faibles de 2-5, une plus grande capacité de survie de M.

bovis comparée à Mmm après 3 jours d’incubation. Ceci est aussi accompagné d’une capacité d’adhérence au support (plastique/cellules) beaucoup plus importante que chez Mmm. Par contre, la prolifération significative (jusqu’à 1 log) des bactéries en suspension observée à 4h en présence de macrophages est comparable pour les deux mycoplasmes. La persistance des mycoplasmes en présence de macrophages peut alors s’expliquer en partie par une balance entre prolifération et élimination, mais dénote aussi une certaine résistance à la phagocytose. Ceci peut s’expliquer par l’absence d’opsonisation dans nos conditions expérimentales. En effet, sans opsonines, la phagocytose, et donc l’élimination par les macrophages de certains mycoplasmes dont M. bovis, est fortement compromise (Howard, 1984; Marshall et al., 1995). Cependant, nos résultats de microscopie confocale indiquent

144 qu’il y a bien eu internalisation des mycoplasmes par les macrophages après 4 heures, et que celle-ci augmente avec la MOI et parait plus efficace pour M. bovis que pour Mmm.

La microscopie confocale a permis de confirmer visuellement la plus forte capacité de M. bovis à se fixer au support de culture par rapport à Mmm. Ce résultat peut s’expliquer par les capacités différentes de M. bovis et Mmm à former des biofilms, comme décrit précédemment (McAuliffe et al., 2006). Cependant, nos résultats montrent également que les macrophages ont un fort effet potentialisateur sur la capacité qu’a M. bovis à proliférer sur le support de culture. L’association entre biofilms et épithélium a été observée in vivo chez la souris pour M. pulmonis (Simmons and Dybvig, 2009) mais il n’y a, à notre connaissance, pas d’étude décrivant un effet amplificateur in vitro par des cellules eucaryotes sur la formation de biofilms par les mycoplasmes. Il serait intéressant de vérifier si cet effet potentialisateur est maintenu en présence d’opsonines (anticorps spécifiques ou sérum non décomplémenté). En effet, la reconnaissance du microorganisme sera alors indirecte et la phagocytose sera dépendante de récepteurs différents tel que les récepteurs au fragment Fc des anticorps et les récepteurs au complément.

De plus, la microscopie confocale a permis de confirmer la présence de mycoplasmes fluorescents, et donc vivants, à l’intérieur des macrophages après 72 heures post-infection, et ceci même aux MOI les plus faibles et en présence de doses bactériostatiques d’antibiotique (pour Mmm). Ceci suggère, soit une résistance à la phagocytose, soit une survie des mycoplasmes dans les macrophages, ou une combinaison des deux, dans les conditions d’infection sans opsonisation.

Nous n’avons pas pu réaliser le test de protection à la gentamicine qui s’est avéré inefficace dans les conditions de culture utilisées dans nos tests cellulaires. En effet, la capacité de M. bovis à adhérer au support de culture, voire à former des structures de type biofilm, pourrait expliquer la perte de sensibilité à la gentamicine par rapport au milieu PPLO (Mah and O’Toole, 2001). D’autres antibiotiques devront être testés dans les mêmes conditions avant de pouvoir poursuivre ce travail. Encore une fois, nous n’avons pas trouvé un antibiotique efficace pour empêcher la prolifération M. bovis dans nos conditions de culture.

145 Dans le cadre des interactions avec les macrophages, l’outil « mycoplasme fluorescent » pourrait être utilisé pour comparer la résistance à la phagocytose en cytométrie en flux, en fluorimétrie ou en microscopie automatisée. En effet, ces techniques de détection rapides et quantitatives, pourraient après le début de l’infection, mettre en évidence les différences en matière de résistance à la phagocytose. Particulièrement, la cytométrie pourrait être très adaptée pour analyser la résistance à la phagocytose de certaines souches. En effet, cette technique resterait exploitable au début de l’infection, quand des quantités importantes de mycoplasmes sont présentes à l’intérieur des macrophages. On pourrait comparer ainsi le comportement des souches virulentes et avirulentes, ou certains variants (avec et sans capsule par exemple) vis-à-vis de la phagocytose. Pour cela il faudrait travailler dans des conditions plus physiologique avec l’ajout de sérum complet contenant du complément et d’autres facteurs qui ont un rôle important dans la phagocytose indirecte (Marshall et al., 1995).

Dans un second temps, nous nous sommes intéressés aux interactions entre les cellules embryonnaires bovines de poumons (EBL) et les mycoplasmes Mmm Rita N6 et M.

bovis Oger2 N8 d’un point de vue de l’adhérence et l’invasion cellulaire. Nous avons pu observer une différence très contrastée entre M. bovis, qui adhère fortement aux cellules, prolifère et les envahi, et Mmm, qui n’adhère que sporadiquement aux cellules. Nous avons pu montrer ainsi, que ce type d’analyse permet de mettre en évidence des différences d’adhésion et invasion entre espèces, souches ou mutants fluorescents à différentes cellules.

Puisque notre outil de marquage est basé sur un plasposon qui permet l’insertion stable et au hasard de la cassette d’expression dans le génome des mycoplasmes, il est parfaitement adapté pour produire des banques de mutants fluorescents. Il serait donc intéressant de développer une méthode de criblage permettant l’identification des mutations responsables de la perte d’adhérence, invasion et prolifération, et donc l’identification de nouveaux facteurs de virulence. Pour cela, il faudrait une méthode d’analyse quantitative suffisamment sensible donc nous devons exclure la cytométrie en flux. Nous envisageons l’utilisation de la fluorimétrie pour l’analyse à haut débit de ces interactions, directement sur la monocouche non altérée, au fond des puits de plaque 96 combinée bien sûr avec des illustrations par microscopie confocale.

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Chapitre 4