Développement de systèmes d’expression de gènes

78 (Janis et al., 2008). Ce plasposon est donc un outil de choix pour les études in vivo ou pour faire des transformations successives.

Au cours de cette thèse, la stratégie d’insertion de gènes hétérologues dans le plasposon pMT85/2res a donc été privilégiée. Ce plasmide a été généreusement fourni par l’INRA de Bordeaux comme outil de mutagénèse aléatoire. Il permet l’insertion aléatoire mais stable d’un gène de résistance à la kanamycine dans le génome des mycoplasmes (figure 9). L’inconvénient principal du plasposon est qu’il n’est pas prévu pour l’expression de gènes et doit être modifié pour le clonage. Par ailleurs, une seule copie du gène est insérée dans le génome. De ce fait, si l’on veut augmenter le nombre de copies du gène à exprimer, il faut réutiliser le système pour insérer plusieurs copies, ce qui est assez chronophage et peut être associé à une importante dérive génétique due aux multiples passages in vitro. C’est pourquoi, et malgré tous les inconvénients cités plus en amont, une stratégie de clonage de la cassette d’expression dans le plasmide oriC de Mmm pMYSO1 a été établie et réalisée en parallèle (figure 11). Le plasmide pCC1 (figure 12) a lui aussi été retenu dans l’objectif d’évaluer l’efficacité du promoteur tufA par rapport au promoteur spiraline, très largement utilisé pour l’expression de gènes chez les mycoplasmes (Renaudin et al., 2014). Le choix de plasmides portant l’oriC de Mmm confère une certaine flexibilité pour utilisation au sein du groupe mycoides car il a été démontré que Mcc peut être transformé avec des plasmides contenant l’oriC de Mmm ou Mmc, tandis que l’inverse n’est pas vrai pour Mmm et Mmc (Lartigue et al., 2003).

Que ce soit pour l’utilisation du pMT85/2res ou des plasmides réplicatifs pCC1 et pMYSO1, les constructions devaient d’abord être faites chez E. coli, en insérant le gène d’intérêt dans le vecteur d’expression, avant de transformer les mycoplasmes.

79 L’analyse des sites de restriction au niveau de cette séquence d’ADN montrait la présence du site de restriction de l’enzyme SpeI.

Une cassette d’expression comprenant le site SpeI, le promoteur tufA de Mmm (Ptuf), un site multiple de clonage (MCS) avec les sites de reconnaissance des enzymes de restriction NcoI, SalI, SacII et AflII, puis le terminateur fib de S. citri (Tfib) et une extrémité XbaI (compatible avec SpeI) a été développée pour clonage dans le plasposon (figure 14).

Cette cassette a été obtenue par plusieurs PCR successives avec queues flottantes, suivies d’une « overlap » PCR comme indiquée dans la figure 14.

La première PCR a permis d’obtenir un fragment contenant le promoteur tufA à partir du génome de la souche Rita de Mmm avec les amorces SpeI_Ptuf_F et NcoI_Ptuf+_R (table 3), possédant des queues flottantes qui contiennent les sites de restriction.

Une seconde PCR a été réalisée pour amplifier le fragment contenant le terminateur fib de S. citri à partir du plasmide pPS3.1 (figure 10), développé par l’INRA de Bordeaux. Les amorces MCS_Ptuf+_Tfib_F et Tfib_XbaI_R (table 3) utilisées ici ont aussi des queues flottantes avec les sites de restriction souhaités.

La troisième PCR est une amplification qui utilise la stratégie « overlap ». Le milieu réactionnel de cette PCR est différent des conditions classiques car il est composé de chacun des deux produits purifiés des PCR précédentes comme ADN matriciel et il n’y a pas d’amorces. Douze cycles de PCR sont réalisés afin de synthétiser les bases manquantes pour assembler les produits des deux précédentes PCR.

La quatrième PCR est réalisée avec le couple d’amorces SpeI_Ptuf_F et Tfib_XbaI_R (Table 3), en utilisant le produit purifié de la PCR précédente comme matrice, pour l’amplification du produit final contenant la cassette d’expression et des extrémités cohésives compatibles SpeI et XbaI.

80 Figure 14

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La première PCR permet d’amplifier le promoteur du gène tuf (Ptuf). La seconde PCR permet d’amplifier le terminateur du gène de la fibrille (Tfib). La troisième PCR (overlap) n’utilise pas d’amorce, mais consiste à synthétiser les bases manquantes entre les deux queues flottantes des produits des PCR 1 et 2. La quatrième PCR permet d’amplifier le produit final.

Cette cassette d’expression a ensuite été digérée par SpeI et XbaI, puis clonée dans le plasposon pMT85/2res digéré par SpeI (figure 15). Ce clonage a permis l’obtention du pMT85/2res modifié pour l’expression de gènes, renommé pMT/exp.

81 Figure 15 : Obtention du vecteur d’expression pMT/exp par clonage dans le pMT85/2res de la cassette comprenant le promoteur du gène tufA de Mmm (Ptuf), le site multiple de clonage (MCS) et le terminateur du gène fib de S. citri (Tfib). Le MCS permet le clonage directionnel de gènes à la suite du promoteur et en amont du terminateur.

· Système utilisant le plasmide réplicatif pMYSO1

La cassette d’expression intégrée dans le pMT85/2res devait ensuite être clonée dans le plasmide réplicatif pMYSO1, afin de pouvoir comparer l’efficacité du système d’expression dans les deux types de vecteurs.

Pour cela, il fallait effectuer une modification mineure. En effet, les sites de restriction aux extrémités de la cassette devaient être différents pour permettre le clonage dans ce plasmide. Nous avons donc dû amplifier par PCR la cassette d’expression en utilisant des queues flottantes comportant les sites de reconnaissance des enzymes SapI pour l’amorce sens SapI_Ptuf_F et SphI pour l’anti-sens SphI_Tfib_R (table 3). La réalisation de cette PCR permet d’obtenir une cassette d’expression pouvant être cloné dans le vecteur pMYSO1 (figure 16).

82 Figure 16 : Stratégie de clonage de la cassette d’expression dans le vecteur réplicatif optimisé pour Mmm. L’insertion doit avoir lieu entre les sites de reconnaissance aux enzymes de restriction SapI et SphI.

Le développement de la construction dans le pMYSO1 n’a pas abouti malgré de nombreux essais pour intégrer la cassette d’expression entre les sites de reconnaissance aux enzymes de restriction SapI et SphI qui se situent dans une région non codante du plasmide.

Nous avons séquencé à nouveau le plasmide dans son ensemble pour vérifier qu’il n’y ait pas eu de problème au niveau des sites de reconnaissance aux enzymes de restriction.

Aucune anomalie n’a été détectée au séquençage. Le développement d’un système d’expression de gènes dans le plasmide réplicatif pMYSO1 de Mmm a été alors suspendu en attendant les résultats de validation du système développé dans le plasposon.

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II.3 Validation des systèmes d’expression par complémentation