C. Effets des mutations topA et fis sur la transcription de ompF
3. Détermination des sites de fixation de Fis sur ompF
Afin de déterminer précisément les sites de fixation de Fis dans la région promotrice de ompF, nous avons réalisé des empreintes à la DNase I sur cette région protégée par Fis (Figure 33). Des quantités croissantes de Fis ont été employées, correspondant aux rapports molaires utilisés dans les expériences de retards sur gel. Quatre couples d’amorces ont été utilisés (Figure 34) pour amplifier par PCR quatre fragments d’ADN de la région promotrice de ompF B, qui ont ensuite permis de réaliser des expériences d’empreintes à la DNase I (Figure 33). Les empreintes à la DNase I révèlent 5 zones de protection par Fis dans la région promotrice de ompF, au sein desquelles sont observés des sites d’hypersensibilité (Figure 33) caractéristiques de la courbure engendrée par la fixation de Fis sur l’ADN, ce qui exposerait particulièrement
Figure 34 : Région promotrice de ompF et localisation des sites de fixation de Fis
La séquence de cette région, correspondant à la souche E. coli K12 MG1655 (Blattner et al., 1997), est donnée, ainsi que la position des amorces utilisées pour les expériences d’empreintes à la DNase I (les flèches indiquent le sens 5’-3’), les sites de fixation des différents régulateurs (voir légende sur la figure), dont les sites de fixation de Fis déterminés dans ce travail. Les bases correspondant à la séquence consensus de Fis sont indiquées par un point, et les pointillés bleus indiquent les zones protégées sur un seul des deux brins. Le +1 de transcription et l’ATG de ompF, ainsi que les boîtes -10 et -35 du promoteur ompF sont indiqués. La direction de la transcription est donnée par une flèche courbe. La région promotrice ompF chez E. coli B présente des différences par rapport à celle d’E. coli K12 ; les positions nucléotidiques modifiées chez E. coli B sont indiquées en vert, en dessous de la séquence, la croix indiquant une délétion du nucléotide indiqué.
Résultats Partie III : Une Nouvelle Fonction de Régulation pour Fis
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quelques bases localisées entre les deux domaines C-terminaux de Fis (Slany et Kersten, 1992).
Cinq sites de fixation de Fis, I à V, ont ainsi été mis en évidence (Figure 34). Le premier est situé en amont de la boîte -35 du promoteur, chevauchant les sites F1, F2 et F3 de fixation de OmpR, ainsi qu’un des sites de fixation d’IHF. L’étendue de ce premier site, des positions -45 à -118, laisse supposer la fixation de plusieurs dimères de Fis, bien qu’un seul site proche de la séquence consensus ait pu être identifié. La localisation de ce site pourrait également suggérer des interactions entre Fis et OmpR au niveau de la régulation de ompF. Les quatre autres sites de fixation de Fis s’étendent des positions -130 à -363 et sont tous localisés entre les sites F1 et F4 de fixation de OmpR. Le centre des différents sites de fixation de Fis est espacé, respectivement de 69pb (I à II), 82pb (II à III), 60pb (III à IV) et 54pb (IV à V). L’éloignement de ces sites pourrait suggérer que les dimères de Fis puissent se fixer pour la plupart du même côté de la double hélice d’ADN et y induire une forte courbure qui entraînerait l’activation de la transcription (Newlands et al., 1992). In vivo, cette région pourrait déjà présenter une courbure intrinsèque importante, puisqu’elle est riche en AT, à laquelle viendrait s’ajouter celle induite par la fixation de Fis.
Nous avons ici démontré que Fis activait la transcription du gène ompF d’E. coli B en se fixant sur 5 sites présents dans la région promotrice. Bien que la régulation des porines soit relativement bien connue chez E. coli K12, et étudiée depuis plus de 30 ans maintenant, aucune régulation par Fis des gènes de porines, que ce soit ompF ou ompC, ou des gènes de régulation ompR et envZ, n’a été répertoriée, ce qui peut paraître surprenant. Ceci pourrait être lié au fait que la régulation que nous venons de mettre en évidence soit spécifique d’E. coli B. Nous avons donc réalisé les mêmes expériences dans l’isolat d’E. coli le plus utilisé en laboratoire : K12. Pour ce faire, nous avons utilisé la souche CF7968, un dérivé Lac- de la souche MG1655, dont la séquence du génome est disponible (Blattner et al., 1997). Au préalable, nous avons construit, toujours en utilisant le plasmide suicide pKO3, une délétion en phase du gène fis dans la souche CF7968 (appelée K12), ce qui nous a permis d’obtenir une souche isogénique CF7968Δfis (appelée K12Δfis). La régulation des gènes ompF et ompR a été comparée dans les 4 souches : B, K12, ainsi que leurs dérivés délétés du gène fis. L’utilisation d’un contexte génétique K12 nous a également permis d’inclure l’analyse de la régulation du
0 500 1000 1500 2000
DO 0,2 DO 0,7 DO 2 DO 7
Croissance cellulaire
Activité spécifique (nkat/mg
Figure 35 : Activités spécifiques β-galactosidase des fusions transcriptionnelles ompF K12-lacZ dans les contextes isogéniques K12 et K12∆fis
Les activités spécifiques β-galactosidase, données en nkat/mg, ont été mesurées après cultures des deux souches en milieu LB et des prélèvements à DO600nm de 0,2 (début de phase exponentielle, 1h de culture), 0,7 (phase exponentielle, 2h de culture), 2 (transition phase exponentielle - phase stationnaire, 3h de culture) et 7 (phase stationnaire, 6h de culture). K12 est la souche CF7968 et K12∆fis la souche CF7968 portant une délétion en phase de fis. Les erreurs standard ont été calculées à partir de 3 cultures indépendantes.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
DO 0,1 DO 0,7 DO 2 DO 3-4 DO 5-7
Croissance cellulaire
Activité spécifique (nkat/mg)
606 606 2 CF
CFK12 ompF B 606 ompF B 606 ompF K12 K12 ompF K12
Figure 36 : Activités spécifiques β-galactosidase des fusions transcriptionnelles ompF B - lacZ ou ompF K12 – lacZ dans les contextes génétiques E. coli B ou K12
Ces mesures ont été effectuées en introduisant chaque fusion ompF B ou K12 – lacZ dans chacune des souches E. coli B (REL606) ou K12 (CF7968) et les activités spécifiques β-galactosidase, données en nkat/mg, ont été mesurées après des cultures en milieu LB en fonction de la phase de croissance. Les prélèvements ont été effectués à des DO600nm de 0,1 (début de phase exponentielle, 1h de culture), 0,7 (phase exponentielle, 2h de culture), 2 (transition phase exponentielle – phase stationnaire, 3h de culture) et 3 et 5 (phase stationnaire, 5h et 9h de culture). Les erreurs standard ont été calculées à partir de 3 cultures indépendantes.
606 ompF B : fusion transcriptionnelle ompF B – lacZ dans E. coli B (REL606) 606 ompF K12 : fusion transcriptionnelle ompF K12 – lacZ dans E. coli B (REL606) K12 ompF K12 : fusion transcriptionnelle ompF K12 – lacZ dans E. coli K12 (CF7968) K12 ompF B : fusion transcriptionnelle ompF B – lacZ dans E. coli K12 (CF7968)
Résultats Partie III : Une Nouvelle Fonction de Régulation pour Fis
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gène ompC, absent chez les dérivés d’E. coli B. La régulation de chacun de ces gènes a été analysée en fonction de la phase de croissance, en phase exponentielle et en phase stationnaire.
D. Régulation des gènes