Trois porines majeures ont été décrites chez E. coli : OmpC, OmpF et OmpA. Les porines sont des protéines insérées dans la membrane externe, qui forment des pores permettant l’entrée passive de petits composants. Elles sont impliquées dans le transport de molécules, la discrimination se faisant essentiellement sur la base de leur taille. Les deux principales, OmpC et OmpF, se différencient par la taille des pores formés, OmpF formant des pores de 1,16nm, alors que ceux formés par OmpC sont plus petits (1,08nm) et rendent ainsi plus difficile la diffusion des molécules (Nikaido et Rosenberg, 1983). La quantité de chacune de ces porines est fonction de la composition du milieu dans lequel se trouve la cellule, et leur régulation se fait de façon opposée. Dans l’intestin par exemple, la concentration en nutriments, mais aussi en composés toxiques comme les sels biliaires, est élevée : dans ces conditions, la quantité de porine OmpC est plus élevée que celle de OmpF. Dans un milieu plus dilué, l’inverse se produit (Pratt et Silhavy, 1995). Dans des conditions de stress osmotique, OmpC est également majoritaire par rapport à OmpF. Ces changements d’expression sont dus à différentes voies de régulation des deux porines, et les mécanismes de régulation ont été particulièrement bien étudiés dans le cas d’un stress osmotique.
La régulation majeure exercée au niveau transcriptionnel passe par l’intermédiaire du système à deux composants OmpR/EnvZ (Hall et Silhavy, 1981). La protéine senseur EnvZ, une histidine kinase, est insérée dans la membrane externe et détecte les variations d’osmolarité de l’environnement. Ses activités de phosphorylation et de déphosphorylation exercées sur le régulateur de réponses OmpR permettent de réguler l’expression de OmpC et OmpF. En effet, suite à des variations d’osmolarité, il y a autophosphorylation de EnvZ sur le résidu H243, puis transfert du groupement phosphate sur le résidu D55 de OmpR, qui régule la transcription des deux porines (Norioka et al., 1986), la phosphorylation de OmpR
Figure 29 : Les régions promotrices des gènes ompF et ompC
A. Régions promotrices des gènes ompC et ompF. Les gènes sont indiqués en italique, les flèches courbées indiquant les sites d’initiation de la transcription. Les sites de fixation de OmpR-P (F1 à F4 pour ompF et C1 à C3 pour ompC) sont indiqués en bleu, alors que les sites de fixation d’IHF sont indiqués en rose. Les positions de début et fin de ces différents sites sont indiquées par rapport aux +1 de transcription majoritaires des deux gènes ompF et ompC. Le gène micF est transcrit de façon divergente par rapport à ompC, les deux régions promotrices étant chevauchantes.
B. Régulation de ompF et ompC par OmpR. A basse osmolarité, la quantité de OmpR-P est basse. Celle-ci se fixe alors sur les sites F1 à F3 en amont du promoteur de ompF et permet son activation, alors que les sites C1 à C3 de la région promotrice de ompC ne sont pas couverts, ce qui entraîne une faible transcription à partir du promoteur de ompC. A plus forte osmolarité, de plus fortes quantités de OmpR-P sont présentes dans la cellule ; le site F4 de ompF est alors couvert par OmpR-P. La formation d’une boucle entraîne alors l’inhibition de la transcription de ompF, alors que la concentration d’OmpR-P est maintenant suffisante pour occuper tous les sites C1 à C3, ce qui permet d’activer la transcription de ompC (Bergstrom et al., 1998).
Résultats Partie III : Une Nouvelle Fonction de Régulation pour Fis
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accroissant sa capacité à se fixer sur les régions promotrices de ompF et ompC (Aiba et Mizuno, 1990). A faible osmolarité, la quantité de OmpR phosphorylé (OmpR-P) est faible, et OmpR-P se fixe alors de façon coopérative sur trois sites à haute affinité, appelés F1 à F3, localisés en amont du promoteur de ompF (Figure 29). Ceci entraîne l’activation de la transcription de ompF, probablement grâce à une interaction avec l’ARN polymérase (Pratt et Silhavy, 1994).
En revanche, cette concentration de OmpR-P n’est pas suffisante pour occuper les trois sites C1 à C3 de la région promotrice de ompC et entraîne donc une transcription à un niveau basal de ce gène. Lors d’un choc osmotique, il y a augmentation de la concentration en OmpR-P suite à l’activité de phosphorylation de EnvZ. OmpR-P se fixe alors sur les trois sites C1 à C3 de moindre affinité en amont du promoteur de ompC, ce qui active sa transcription, mais aussi sur un quatrième site d’affinité moindre appelé F4, localisé en amont des sites F1 à F3 de ompF. Ceci entraînerait le recouvrement des quatre sites en amont du promoteur et la formation d’une boucle d’ADN, ce qui inhiberait la transcription de ompF (Figure 29B ; Bergstrom et al., 1998 ; Mattison et al., 2002). La transcription des gènes ompF et ompC est également régulée par un second système à deux composants CpxA-CpxR (Batchelor et al., 2005) et par la protéine de type histone IHF qui se fixe sur deux sites en amont de ompF, ce qui entraîne une inhibition de la transcription (Ramani et al., 1992), qui est levée par OmpR-P. Des analyses génétiques ont également révélé que Lrp (Ferrario et al., 1995), CRP (Scott et Harwood, 1980) et H-NS (Suzuki et al., 1996) pouvaient jouer un rôle dans la régulation de ompF et ompC.
L’expression des porines est également régulée de façon post-transcriptionnelle par de petits ARNs, MicF, MicC et MicA, dont la séquence est complémentaire de l’extrémité 5’ non traduite des ARNm de OmpF, OmpC et OmpA, respectivement (Delihas et Forst, 2001 ; Chen et al., 2004 ; Udekwu et al., 2005). Ainsi, l’hybridation de ces trois ARNs au niveau des ARNm entraîne l’inhibition de la traduction de OmpF, OmpC et OmpA. De plus, le gène micF est transcrit de façon divergente à ompC (Figure 29A), et est activé de la même façon en cas de stress osmotique. Ceci a pour effet une inhibition très rapide de OmpF dans ces conditions (Ramani et al., 1994). La régulation de ompF par H-NS (Suzuki et al., 1996) et Lrp (Ferrario et al., 1995) est réalisée par l’intermédiaire de micF.
Chez E. coli B, une région correspondant à la totalité de micF et à une partie de ompC est délétée (Schneider et al., 2002). Ainsi, OmpF est la seule porine majoritaire présente chez E. coli B etsa régulation négative par micF est absente.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
DO 0,1 DO 0,8 DO 4-5 24h
Croissance cellulaire
Activité spécifique (nkat/mg) 606 topA-1
Figure 30 : Activités spécifiques β-galactosidase correspondant aux fusions ompFB-lacZ dans différents contextes génétiques isogéniques du clone ancêtre
Les activités spécifiques β-galactosidase, données en nkat/mg ont été mesurées après cultures des différentes souches en milieu LB et prélèvements à DO600nm de 0,1 (début de phase exponentielle, 1h de culture), de 0,8 (fin de phase exponentielle, 2h de culture), de 4-5 (phase stationnaire, 5h de culture), et après 24h de culture. A ce dernier temps, la mesure correspondant à l’activité de ompF dans 606topA-1 n’a pas été réalisée. 606, souche ancêtre REL606 ; 606fis-1, 606 portant l’allèle évolué fis de la population Ara-1 ; 606Δfis, 606 avec une délétion en phase de fis ; 606topA-1, 606 portant l’allèle évolué topA de la population Ara-1. Les erreurs standard ont été calculées à partir de 3 cultures indépendantes.
0 500 1000 1500 2000 2500
0,086 0,200 0,500
Concentration en NaCl (M)
Activité spécifique (nkat/mg)
606 DO2 606 DO2 606 DO4 606 DO4
Δfis Δfis
Figure 31 : Activités spécifiques β-galactosidase des fusions ompFB-lacZ en fonction de la concentration en NaCl
Les activités spécifiques β-galactosidase, données en nkat/mg ont été mesurées après cultures des différentes souches en milieu LB classique (0,086M NaCl), et en milieu LB avec 0,2 et 0,5M NaCl. Des prélèvements de chaque culture à DO600nm de 0,2 (phase exponentielle, 1h de culture) et de 4 (phase stationnaire, 5h de culture). 606, souche ancêtre REL606 ; 606Δfis, 606 avec une délétion en phase de fis. Les erreurs standard ont été calculées à partir de 3 cultures indépendantes.
Résultats Partie III : Une Nouvelle Fonction de Régulation pour Fis
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Au vu des résultats obtenus par électrophorèse bidimensionnelle, nous nous sommes d’abord intéressés à l’effet des mutations topA et fis sur la transcription de ompF chez E. coli B dans nos souches isogéniques dérivées du clone ancêtre.