Notre approche de crible de complémentation du phénotype CoGAM dans les cellules MCF-7 inhibées pour l’expression de Drosha nous a permis d’identifier plusieurs miRNAs capables de soutenir individuellement la prolifération de ces cellules tumorales. Nous avons testé la complémentation par une trentaine de miRNAs individuels. Idéalement, notre système pourrait être utilisé pour cribler une banque de vecteurs d’expression de tous les miRNAs humains connus, ce qui permettrait éventuellement d’identifier d’autres miRNAs d’intérêt dans le soutien de la prolifération tumorale. Parmi les miRNAs que nous avons identifiés, miR-19a, miR-19b et miR-20a, 3 miRNAs du cluster oncogène miR-17-92, se sont avérés les plus efficaces dans la restauration de la formation des colonies. miR-19 et miR-20 appartiennent au même cluster mais ne possèdent pas la même séquence noyau. Il est intéressant de noter que ces miRNAs oncogènes ont aussi été identifiés par l’équipe de Blelloch dans le crible de complémentation de la prolifération des cellules ES de souris DGCR8-/- (Wang et al., 2008d) (Figure 25). Dans notre crible de complémentation, nous avons identifié d’autres miRNAs possédant la même séquence noyau que miR-20, mais plutôt spécifiques des cellules souches : miR-302b et miR-372. Des miRNAs de ces familles ont aussi été identifiés par l’équipe de Blelloch, les miRNAs de la famille miR-290 (ici miR-291, 294 et 295) chez la souris étant les homologues de la famille miR- 372/373 chez l’homme (Figure 25). Ces résultats dans deux contextes cellulaires différents sont donc cohérents avec l’implication de ces miRNAs dans le soutien de la prolifération. Cependant,
UAAGUGCUUCCAUGUUUUAGUAG miR-302b + + (1)
UAAGUGCUUCCAUGUUUCAGUGG miR-302c + ND
UAAGUGCUUCCAUGUUUCAGUGG miR-302d + ND
AAAGUGCUGCGACAUUUGAGCGU miR-372 ND + (1)
AAAGUGCUUCCACUUUGUGUGC miR-291a-3p + ND
AAAGUGCAUCCAUUUUGUUUGU miR-291-b-3p + ND
AAAGUGCUUCCCUUUUGUGUGU mir-294 + ND
AAAGUGCUACUACUUUUGAGUCU mir-295 + ND
UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG miR-20a + + (2)
CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG miR-20b + ND
AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG miR-106a + ND
CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG miR-93 + ND
UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA miR-19a + + (3)
UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA miR-19b - + (3)
GUGCAUUGUAGUUGCAUUGCA miR-33a + +
UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC miR-27b - + (4)
(UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC mir-27a) - -
AGAGCUUAGCUGAUUGGUGAAC miR-27b* - ?
(AGGGCUUAGCUGCUUGUGAGCA mir-27a*) - -
humain
Spécifiques cellules ES
souris
Complémentation de la prolifération dans
les cellules ES
DGCR8-/- de souris (Wang et al., 2008)
Complémentation de la prolifération dans les cellules MCF-7
shDro (Peric et al., 2011)
des cinétiques de complémentation nous ont permis de mettre en évidence des différences fonctionnelles entre ces miRNAs de la même famille. En effet, la complémentation par miR-302b ou miR-372 est beaucoup moins efficace dans les cellules MCF-7 que celle obtenue par miR-20, et, sur le long terme, les colonies formées grâce à l’expression de miR-302b ou miR-372 régressent tandis que celles formées grâce à l’expression de miR-20 continuent de proliférer.
Ceci suggère que miR-20 et les miRNAs des cellules souches possèdent certaines cibles en commun mais que la répression d’autres cibles spécifiques à miR-20 permet de complémenter plus efficacement le défaut de prolifération dans le contexte des cellules tumorales MCF-7.
Figure 25 : Comparaison de nos résultats de complémentation dans les cellules MCF-7 shDro avec ceux dans les cellules ES DGCR8-/-. Récapitulatif et comparaison des miRNAs identifiés dans notre crible de complémentation du phénotype CoGAM dans les cellules MCF-7 shDro (Peric et al., 2011) avec ceux identifiés par l’équipe de Robert Blelloch dans le crible de complémentation du défaut de prolifération des cellules ES DGCR8-/- (Wang et al., 2008d). Les régions des séquences noyau communes à plusieurs miRNAs sont surlignées de la même couleur, indiquant des miRNAs de la même famille. miR-27a (et miR-27a*), qui ne complémente pas, est représenté à titre indicatif pour comparaison avec la séquence miR-27b (et miR-27b*). Les nucléotides qui distinguent miR-27a de miR-27b, et miR-27a* de miR-27b*
sont en rouge. (1)peu de clones et régression avec le temps, (2)beaucoup de clones et durable, (3)beaucoup de clones et régression avec le temps, (4)peu de clones mais durable. ND = non déterminé.
Cette différence fonctionnelle est également mise en évidence par les différences des complémentations obtenues avec miR-19b et miR-20a. De la même manière, des cinétiques de complémentation montrent que si miR-19b complémente très efficacement la formation des colonies dans un premier temps, celles-ci régressent sur le plus long-terme. L’identification de ces miRNAs nous a permis de montrer que PTEN, une de leur cible commune, était impliquée dans le phénotype CoGAM. Cependant, les différences observées suggèrent là encore que l’inhibition conjointe d’autres cibles régulées par miR-20, par exemple des facteurs pro- apoptotiques, permet de restaurer une prolifération durable en l’absence d’autres miRNAs.
L’équipe de Blelloch a proposé que la dé-répression de cibles inhibitrices de la transition G1-S, dont p21, soit responsable du ralentissement de la prolifération dans les cellules ES. Ils ont montré que l’expression de p21 était induite dans les cellules ES DGCR8-/- et inhibée par l’expression des miRNAs de la famille miR-290 et miR-302 dans ces cellules (Wang et al., 2008d).
Toutefois, ils n’ont pas pu inhiber l’expression de p21 dans ces cellules afin de voir si cela permettait de complémenter le défaut de prolifération, ce qui aurait permis de confirmer l’implication directe de p21. Dans les cellules dépendantes du microprocesseur, nous avons montré que l’inhibition de p21 ne suffisait pas à restaurer la prolifération des colonies.
Nous avons par ailleurs identifié 2 autres miRNAs capables de complémenter partiellement le phénotype CoGAM : miR-33a et miR-27b. Ces deux miRNAs ont peu été associés à la tumorigenèse. Notre approche permet de montrer qu’ils sont capables de soutenir individuellement la prolifération de cellules tumorales, indiquant un rôle potentiellement oncogénique de ces miRNAs. Une étude a montré que la surexpression de miR-33a avec l’oncogène RasV12 permettrait de transformer des MEFs, grâce à la répression de p53 par miR-33a (Herrera-Merchan et al., 2010). Les auteurs ont identifié 2 sites potentiels de réponse à miR-33a, sans séquence noyau, dans le 3’UTR de p53. Cette étude met donc en évidence un rôle oncogène de miR-33, alors qu’une autre étude a proposé que miR-33 agisse plutôt comme un suppresseur de tumeur en ciblant le proto-oncogène Pim-1 dans certaines lignées tumorales (Thomas et al., 2011). Si le rôle de miR-33 dans les tumeurs n’est donc pas très clair, nous pouvons cependant tirer plusieurs remarques de nos résultats. D’abord, miR-33 fait aussi partie des miRNAs capables de complémenter le défaut de prolifération des cellules ES DGCR8-/-, ce qui confirme que ce miRNA favorise la prolifération dans différents contextes cellulaires. Ensuite, dans la séquence 5’ de miR-33, nous avons noté 5 nucléotides en commun avec la séquence noyau de miR-19 (Figure 25), ce qui suggère que miR-33 puisse complémenter partiellement la formation des colonies grâce à la répression de cibles communes avec miR-19. Enfin, malgré l’étude indiquant que p53 serait une cible de miR-33, l’inhibition de p53 dans les cellules MCF-7 n’a pas permis de complémenter la prolifération des cellules inhibées pour Drosha. La
complémentation partielle par miR-33 passe donc vraisemblablement par l’inhibition d’autres cibles.
miR-27b a été associé à des signatures de mauvais pronostic et aux tumeurs plus invasives dans les cancers du sein (Buffa et al., 2011) (voir Tableau 1 dans l’introduction). Une autre étude a montré que miR-27b était surexprimé dans des échantillons de tumeurs du sein par rapport au tissu normal, et a montré que la surexpression de miR-27b dans les cellules ZR-75-1 favorisait la prolifération, l’invasion et la migration, et que son inhibition dans une lignée métastatique avait les effets inverses (Wang et al., 2009). miR-27a est également exprimé dans les lignées de cancer du sein et il a été décrit comme favorisant la prolifération des cellules MDA-MB-231 (Mertens- Talcott et al., 2007). miR-27a et miR-27b ne différent que par un nucléotide hors de la séquence noyau (Figure 25). Pourtant, miR-27a ne permet pas de restaurer la formation des colonies dans notre crible, tandis que miR-27b est capable de complémenter, partiellement mais durablement, la formation des colonies. Cette différence semble peu attribuable au seul nucléotide hors de la séquence noyau qui différencie miR-27a de miR-27b. Plusieurs hypothèses permettraient d’expliquer la différence obtenue entre miR-27a et miR-27b. Tout d’abord, notons que dans notre approche de complémentation, les miRNAs sont exprimés à partir des séquences naturelles des pre-miRNAs qui permettent de produire également les miRNA*. Si les brins miRNA* ou passagers ont longtemps été considérés comme éliminés et non fonctionnels, différentes études montrent aujourd’hui que les ratios miRNA /miRNA* varient considérablement (entre 1 et plus de 100) en fonction du pre-miRNA et en fonction du tissu ou du type cellulaire considéré (Ro et al., 2007; Biasiolo et al., 2011; Kuchenbauer et al., 2011). Les brins miRNA* sont donc dans certains cas exprimés de manière non négligeable et il a été montré qu’ils permettaient également de réprimer l’expression de cibles (Ro et al., 2007;
Okamura et al., 2008; Yang et al., 2011). Dans le crible de complémentation de l’équipe de Blelloch, des duplexes de miRNAs, optimisés pour intégrer préférentiellement le brin mature dans le complexe RISC, ont été utilisé (www.dharmacon.com). Ceci suggère que les complémentations que nous avons obtenues par plusieurs miRNAs trouvés en commun avec cette étude et qui de plus, partagent la même séquence noyau, passe vraisemblablement par le brin mature. Dans le cas de miR-27b en revanche, il est possible que le brin miR-27b*, qui diffère de miR-27a* de plusieurs nucléotides dont un dans la séquence noyau (Figure 25), intervienne dans la complémentation. Il serait intéressant de tester différentes combinaisons de miRNA/miRNA* en modifiant les séquences naturelles des pre-miR-27a et pre-miR-27b dans nos vecteurs d’expression, afin de voir si miR-27b* est effectivement nécessaire à la complémentation. On pourrait également regarder si miR-27b* seul suffit à complémenter ou s’il est possible que le brin mature et le brin passager coopèrent dans la complémentation du
phénotype CoGAM. Une expression et une action coordonnée de miR-9 et miR-9* a par exemple été démontrée dans les cellules souches cancéreuses de glioblastome (Schraivogel et al., 2011).
Une autre possibilité est que, grâce à un mécanisme de régulation spécifique de pre-miR-27a, celui-ci ne s’exprime pas dans les cellules MCF-7. En effet, nous avons contrôlé l’expression de tous nos vecteurs d’expression de pre-miRNAs par une méthode standardisée que nous avons mis au point dans les cellules HeLa. Nous savons donc que le vecteur d’expression de pre-miR- 27a est fonctionnel. Cependant, il est possible qu’une séquence, présente par exemple dans la boucle de pre-miR-27a, permette de réguler spécifiquement sa maturation ou sa dégradation dans le contexte cellulaire des MCF-7. Il conviendrait donc de vérifier que miR-27a s’exprime dans les MCF-7. Dans le cas contraire, il serait intéressant de déterminer par quel élément dans la séquence et par quel mécanisme miR-27a ne s’exprime pas. Nous disposons d’un système nous permettant de tester facilement ces différentes hypothèses en modifiant les séquences des pre-miRNAs naturels et en testant lesquels sont capables de faire pousser des colonies MCF-7 shDro. Cela pourrait permettre de mettre en évidence un rôle fonctionnel majeur d’un miRNA*
ou bien un mécanisme de régulation spécifique d’un pre-miRNA, expliquant une telle différence fonctionnelle entre 2 miRNAs homologues.