Génération d’une souris délétée pour NUT

Une méthode efficace pour obtenir des informations de l’importance et des fonctions d’une protéine est d’observer les effets de son absence dans un organisme. Nous avons donc entrepris de réaliser la délétion du gène NUT chez la souris, et je participe actuellement avec Faycal Boussouar et Thierry Buchou à l’élaboration de ce projet. La génération de ces souris se fera par recombinaison homologue entre deux vecteurs et le génome d’une cellule ES. In fine, nous obtiendrons une souris hétérozygote délétée pour le second exon du gène NUT, avec insertion d’une cassette Neo à la place, ce qui aura pour effet de perturber la transcription de NUT et rendra inactif le gène (Fig.7). Nous avons délibérément choisi de ne pas cibler le premier exon pour plusieurs raisons : Premièrement, celui-ci est court, et code seulement quelques acides aminés. Il n’est ainsi pas exclu que la transcription puisse sauter une délétion si peu importante dans la région codante de NUT. Deuxièmement, il n’existe actuellement aucune donnée claire des régions promotrices de NUT, et il subsiste un flou sur l’origine de transcription du gène. En effet, les bases informatiques diffèrent entre elles quant à la région 3’ transcrite du gène NUT, certaines faisant référence à un premier exon antérieur au premier exon admis par la base de données Pubmed. Une délétion du premier exon délimité par Pubmed pourrait donc ne pas empêcher la transcription à partir de cet autre potentiel départ de transcription. Enfin, la région 3’ du gène NUT est également la région 3’

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d’un gène du brin complémentaire, NOLA. Une fois encore, les séquences promotrices ne sont pas définies, mais de par leur proximité, il est quasi certain que les séquences promotrices et activatrices de NUT et NOLA se chevauchent tête-bêche. Déléter les régions avoisinantes du premier exon de NUT pourrait ainsi avoir pour conséquence une perte d’expression simultanée de NOLA. Les gènes NUT et NOLA semblent transcrits de façon exclusive d’après analyse de données transcriptomiques, et donc l’invalidation de NUT et NOLA au cours de la spermatogenèse ne devrait pas avoir de conséquences inhérentes à NOLA. Cependant, cette protéine est ubiquiste et importante pour le fonctionnement de la cellule. En effet, la protéine NOLA fait partie de la famille des H/ACA snoRNPs (petites ribonucleoproteines nucléolaires) qui participent à la formation des ARN ribosomaux. La répression d’un seul membre de cette famille a pour conséquence l’incapacité de fabrication des ARNr 18S par exemple, avec bien entendu des conséquences drastiques pour la cellule. Il est donc vital de ne pas perturber l’expression de ce gène : c’est pour cela que nous avons décidé de cibler l’exon 2 de NUT. Nous nous attendons à obtenir un phénotype spécifique des cellules germinales, provoquant une infertilité. Potentiellement, l’altération de la vague d’acétylation pourrait être un des phénotypes facilement observables nous renseignant sur la fonction de la protéine NUT.

Cette partie de mon projet n’a pas encore donné suite à un article, car nous entamons la création de souris délétées pour le gène NUT, afin d’accroître l’importance des résultats déjà obtenus lors de ma thèse. Thierry Buchou et Faycal Boussouar au sein de notre laboratoire continueront le travail entamé pour la génération de ces souris. Les connaissances et les outils du laboratoire permettront une analyse rapide des phénotypes espérés lors de la spermatogenèse.

Matériel et Méthode

Les techniques et matériels préalablement détaillés dans la publication d’Embo J. ne seront pas détaillés ici, ainsi que les méthodes expérimentales du laboratoire issues de publications antérieures.

RT-PCR, Q-PCR et PCR et anticorps:

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RT-PCR :

NUT souris : F’ CAGGACTTCCTCTGCAGGTC et R’ CCCTGGAGGATCAAGTTTCA Q-PCR

NUT souris : F’ GAGAACTATCGTCGCTGGCAG et R’ ACGAAGCACTGGGATA AGGAA

BRD4 souris F’ TTCAGTCAAGGGAACCATCACT et R’ AGGCAGGACCTGTTTCA GAGT

NUT humain : F’ AGGCTGTCATTCACCCTCAA et R’ CTCTTCCAAGGCCATGAGTC Les anticorps utilisés sont : anti-Nut lapin (cell signaling), anti-NF1 lapin (abcam), anti-Stim1 souris (BD Biosciences), anti-p300 lapin (Santa Cruz).

Spermatogenèse souris et rat

Les expériences d’immunofluorescence ont été réalisées sur des cellules germinales à partir de tubules micro-dissequés, préparés comme décrit par (Kotaja et al, 2004).

Le protocole d’immunofluorescence est détaillé dans (Govin et al, 2007).

Le protocole d’immunohistochimie sur coupe de testicule en paraffine a été décrit dans (Faure et al, 2003).

Le fractionnement cellulaire s’est fait sur un gradient de BSA 2-4% selon le protocole détaillé dans (Pivot-Pajot et al, 2003).

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Figures

Figure 1 : Expression spécifique de NUT au sein du tissu testiculaire chez la souris et l’humain A) Extractions ARNs de différents tissus de souris, suivies d’une transcription inverse. Les transcrits du gène NUT ont été détectés à l’aide d’une amplification PCR à partir d’amorces spécifiques puis migration par électrophorèse sur un gel d’agarose 1%.

B) PCR quantitative en temps réel à partir d’une banque humaine d’ADN complémentaires.

L’expression des transcrits NUT à partir d’amorces spécifiques au sein de vingt tissus humains a ensuite été normalisée par rapport à un gène de ménage tel GAPDH et U6.

p. 171 Figure 2 : profil d’expression de NUT au cours de la spermiogenèse murine

L’expression du transcrit NUT a été détectée par PCR quantitative en temps réel sur différentes populations enrichies de cellules germinales mâle de souris. Le profil d’expression des gènes BRD4, H4 et TP1 sert de référence et confirme la bonne purification des cellules germinales.

L’ensemble des transcrits a été normalisé par rapport au gène de ménage GAPDH.

p. 172 Figure 3 : La protéine est présente du début des spermatides rondes jusqu’aux spermatides allongées/condensées chez le rat.

A) Marquage de la protéine NUT par immunohistochimie dans les tubes séminifères chez le rat.

Les coupes de testicules inclus dans la paraffine sont coupées en lames de 5 à 10 microns puis colorées au PAS/HE afin de permettre de « stader » les différents tubules. Les spermatides rondes correspondent aux stades II à VIII chez le rat, puis lors des stades IX à XI les spermatides s’allongent et se condensent jusqu’à former les spermatozoïdes.

B) Marquage par immunofluorescence de la protéine NUT (anticorps secondaire anti-lapin a488). Le marquage au Hoechst du noyau des cellules permet de différencier les cellules germinales entre elles. Brièvement, les tubules sont séparés les uns des autres puis découpés en section. Ces sections contiennent des combinaisons de différentes cellules germinales, qui

seront congelées à l’azote liquide avant réalisation d’une immunofluorescence sur lame.

p. 173 Figure 4 : CBP/p300 et NUT sont localisés au niveau de complexes spermatiques de même taille

A) Immunodétection de CBP/p300 et NUT au sein des spermatides rondes et spermatides en allongement chez le rat

B) Immunodétection de CBP/p300 et NUT au sein de fractions communes après chromatographie par exclusion de taille.

p. 174 Figure 5 : Le complexe NUT endogène contient une activité HAT

A) Test d’activité HAT réalisé soit à partir d’extraits cytoplasmiques ou nucléaires de cellules germinales après précipitation de protéines liant le fragment NUT F1c-GST, soit à partir d’extrait total de cellules germinales après co-immunoprécipitation de protéines par l’anticorps anti-NUT.

B) Immunofluorescence sur cellules germinales de souris après dissection de tubules. Les noyaux ont été colorés au Hoescht (bleu) et la marque H3K56ac détectée grâce à un anticorps spécifique (vert). Les spermatides rondes (panel du haut) et les spermatides allongées (panel du bas) présentent un marquage significatif.

p. 175 Figure 6 : Identification de partenaires physiologiques de NUT

A) Electrophorèse sur gel gradient et coloration Coomassie. Les protéines co-immunoprécipitées spécifiquement par l’anticorps anti-NUT sont colorées et envoyées à anlayse par spectrométrie de masse pour identification.

B) Contrôle de certains des partenaires identifiés par spectrométrie de masse. Analyse par immunoprécipitation anti NUT à partir d’extrait testiculaire, couplée à la détection directe par anticorps des protéines interagissant ou par expression ectopique et co-immunoprécipitation de NUT et la protéine H1t étiquetée.

p. 176 Figure 7 : Génération de souris délétées pour le gène NUT

Stratégie de délétion du gène NUT chez la souris, par recombinaison homologue et insertion d’une cassette Neo à la place d’une partie de l’intron 1-2 et de l’exon 2.

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Discussion

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I) Remodelage épigénétique au cours de la