Projet 3 Conséquences de l’expression illégitime de NUT au sein de lignées cellulaires
VII) NUT confère un avantage prolifératif dans différentes lignées humaines
Comme la lignée de cellules A7R5 n’est pas une lignée véritablement tumorale, nous avons voulu rechercher la protéine NUT au sein de cellules tumorales humaines mieux caractérisées. Un gel SDS-Page de différents extraits cellulaires nous a permis d’identifier au moins deux autres lignées cellulaires exprimant anormalement la protéine testiculaire NUT.
Ainsi, la lignée tumorale pulmonaire A549 et la lignée tumorale d’ostéocarcinome U20S sont deux autres exemples de lignées exprimant au moins un facteur C/T, la protéine NUT (Fig.7A).
Tout comme pour les cellules A7R5, nous avons voulu savoir si NUT conférait un avantage prolifératif à ces deux lignées cellulaires. Nous avons réitéré les analyses par cytométrie en flux des cellules après incorporation de BrdU suite à des transfections de siRNA NUT ou contrôle. Dans ces deux lignées, une répression de l’expression de NUT entraine un blocage massif des cellules en phase G2/M (Fig.7B). En effet, les cellules A549 passent de 10% de cellules en phase G2/M à 48% trente-six heures après transfection de siRNA NUT. De façon encore plus drastique, les cellules U2OS passent de 15% à 66% de cellules en phase G2/M. Ces observations confirment l’avantage certain qu’apporte à ces cellules l’expression de la protéine NUT.
Nous avons cherché à mieux caractériser la fenêtre de temps ciblée par l’inhibition de la protéine NUT. Pour cela nous avons incubé nos cellules apres siRNA NUT ou non en présence d’une drogue inhibant la polymérisation des microtubules, la Colcemid. Cette drogue bloque le cycle cellulaire en mitose, après la condensation des chromosomes, mais avant leur ségrégation du fait de l’incapacité des cellules à former les fuseaux mitotiques. Les chromosomes peuvent être detectés grâce à la marque H3S10ph spécifique de leur condensation en mitose. Nous avons ainsi pu mettre en évidence que le siRNA NUT bloque les cellules avant l’action de la Colcemid, car les cellules sont bloquées sans condensation de leurs chromosomes (Fig. 8). Ceci suggère donc fortement que l’inhibition de NUT entraîne un arret du cycle avant la mitose, vraisemblablement lors du point de contrôle entre les phases G2 et M.
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Afin de mieux caractériser les conséquences de l‘expression illégitime de NUT, nous avons démarré une étude transcriptomique sur les cellules U2OS grâce à une collaboration avec Philipe Guardiola du CHU d’Angers. Nous avons réalisé une cinétique du transcriptome des cellules U20S après 16h, 24h et 36h de transfection avec le siRNA NUT. Les premières analyses réalisées au sein du laboratoire par Sophie Rousseau et alexandra De Bernardi sont extrêmement encourageantes. En effet, l’expression d’environ cinq milles gènes se trouve dérégulée lors de l’inhibition de l’expression de NUT dans les U2OS (Fig. 9). De plus, ces gènes peuvent être classés en clusters, en fonction de leur cinétique de réponse à l’inhibition de NUT, ceci nous permettant de rechercher des cascades de signalisation. Enfin, une analyse préliminaire par Ingenuity des fonctions des gènes ciblés permet d’identifier des familles de gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire et de la mort cellulaire. NUT semble donc apporter un avantage proliferatif certain aux cellules U2OS. Nous confirmerons par PCR quantitative en temps réel les variations d’expression de gènes clés détectées par l’analyse, et nous efforcerons ensuite de valider certaines des voies de signalisation influencées par NUT.
Une de nos hypothèses de travail est que la protéine NUT dérégule l’activité d’un facteur clef de l’homéostatise cellulaire, et la protéine CBP/p300 est un candidat idéal. En effet, nous avons pu démontrer que NUT interagit avec et stimule CBP/p300, et des données de la littérature indique qu’une inhibition de CBP/p300 soit correlée avec un arrêt en G2/M des cellules. Ainsi, lors de l’inhibition de NUT, CBP/p300 ne serait plus suffisamment stimulée pour induire l’avantage prolifératif nécessaire à la division des U2OS.
Ce travail devrait donner lieu à une soumission d’article avant la fin de l’année dans lequel je serais co-premier auteur avec Karin Sadoul, qui se chargera avec l’aide d’autres personnes du laboratoire de terminer les analyses transcriptomiques et les experiences supplémentaires à réaliser après mon départ.
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Figures
Figure 1 : Détection d’un doublet acétylé au sein des cellules A7R5
A) Les cellules ont été incubées 3h en présence ou absence d’inhibiteurs de HDACs, puis les protéines acétylées ont été révélées par un anticorps anti-Kac.
B) Détection de protéines acétylées après fractionnement cellulaire.
C) Détection du doublet acétylé au sein d’extraits de cellules cultivées à différentes conditions de confluence.
p. 154 Figure 2 : Identification de la protéine NUT
A) Séquence de la protéine NUT et des différents peptides identifiés par spectrométrie de masse (rouge et vert). Les lysines acétylées sont marquées d’un rond bleu.
B) Confirmation du doublet et de NUT par siRNA NUT des cellules A7R5 et détection de la protéine par des anticorps anti-Kac ou anti-NUT.
p. 155 Figure 3 : Domaines de NUT et localisation dans les cellules A7R5
A) Schéma de la protéine NUT et des différentes séquences potentielles identifiées par bioinformatique
B) Immunofluorescence dans les A7R5 avec ou sans traitement aux inhibiteurs de HDACS après détection grâce à l’anticorps anti-NUT et coloration des noyaux au Hoescht.
p. 156 Figure 4 : Influence de l’acétylation sur la localisation cellulaire de NUT
A) Immunofluorescence dans des cellules COS transfectées avec le vecteur NUT WT ou NUT∆NLS1&2, après différents traitements cellulaires.
B) Représentation graphique de la localisation cellulaire des différents mutants de NUT.
p. 157 Figure 5 : Acétylation de la protéine NUT humaine
A) Test d’activité HAT par incubation de la protéine recombinante p300 avec différents fragments de la protéine NUT. Gel électrophorèse et détection de l’efficacité du test HAT par reconnaissance des fragments acétylés par l’anticorps anti-Kac (panel du haut), et gel Coomassie des différents fragments NUT découpés et utilisés pour l’analyse.
B) Analyse de l’acétylation des fragments NUT par spectrométrie de masse et Q-TRAP. Les résidus acétylés sont entourés d’un carré rouge (double identification) ou rose (simple identification)
p. 158 Figure 6 : NUT régule la prolifération des A7R5
Analyse par cytométrie en flux de l’incorporation de BrdU et de coloration au Hoescht des cellules A7R5 après un traitement de 24h de siRNA NUT ou siRNA contrôle. Les graphiques circulaires représentent le pourcentage de cellules comptabilisées dans chaque phase du cycle cellulaire.
p. 159 Figure 7 : NUT régule la prolifération des lignées cellulaires humaines A549 et U2OS
A) Immunodétection de la protéine NUT au sein de différentes lignées cellulaires.
B) Analyse par cytométrie en flux de l’incorporation de BrdU et de coloration au Hoescht des cellules A549 et U2OS après un traitement de 36h de siRNA NUT ou siRNA contrôle. Les graphiques circulaires représentent le pourcentage de cellules comptabilisées dans chaque phase du cycle cellulaire.
p. 160 Figure 8 : L’inhibition de NUT bloque les cellules U2OS au point de contrôle G2/M
Détection en immunofluorescence sur lame ou en cytométrie de flux de la marque H3S10ph spécifique de la condensation des chromosomes. Les cellules ont été traitées avec de la Colcemid, qui bloque les cellules en mitose avant la formation des fuseaux mitotiques.
p. 161 Figure 9 : Analyse transcriptomique après cinétique de siRNA NUT des cellules U20S
Les cellules U2OS ont été incubées pendant 16, 24 ou 36h avec un siRNA NU, puis l’expression des gènes a été analysée en transcriptomique par la technique Illumina. La représentation en Heatmap regroupe les gènes dont l’expression est dérégulée en focntion de la cinétique d’incubation. Par la suite, une analyse fonctionnelle des gènes dérégulée a été effectuée grâce à Ingenuity.
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