La séquence opérationnelle développée ici s’apparente à ce qui est fait lors de l’isolement et la caractérisation spectroscopique d’une nouvelle molécule. Le mélange est d’abord fractionné par différentes techniques chromatographiques, telles la chromatographie sur colonne (CC), la chromatographie sur couche mince (CCM), la CLHP et la CPG préparative (CPGP) précédées ou non d’une distillation fractionnée ou d’une cristallisation.
Les différents constituants isolés ou présents dans des fractions enrichies sont ensuite identifiés par comparaison de leurs données spectrales avec celles de composés de références : spectre de masse, spectre IR, spectres de RMN du 1H ou du 13C (lorsque la quantité de produit isolé est suffisante), éventuellement RMN bidimensionnelle. Cette voie est extrêmement fiable et permet d’identifier les composés présents dans les mélanges naturels et décrits dans la littérature.
Cette séquence en deux étapes « purification-identification » est la première qui a été utilisée dans le domaine des huiles essentielles. Par la suite, elle a été supplantée par la voie A, plus rapide. Mais elle est toujours utilisée dans le cas des huiles essentielles complexes car sa grande fiabilité compense l’investissement en temps qu’elle requiert. Pour illustrer l’intérêt de cette méthode de travail, nous pouvons citer à titre d’exemple, les travaux de Weyerstahl et al., qui ont décrit la composition chimique de diverses huiles extrêmement complexes (Weyerstahl et al., 1996/1997/2000a/2000b/2000c ; Weyerstahl et Schlicht, 1997). Ainsi, l’huile essentielle de Vétiver d’Haïti est réputée pour être l’une des plus complexes du monde
propriétés physico-chimiques et aux données spectroscopiques voisines. Il est par conséquent très difficile d’isoler ces composés et de les identifier. L’huile essentielle a été fractionnée suivant une partition acido-basique. La partie neutre a été soumise à une distillation fractionnée qui a permis de séparer les produits lourds des produits légers, puis les différents constituants ont été séparés par CC répétitives puis éventuellement par CCM. Ces constituants ont ensuite été analysés par CPG-SM, RMN 1H, et parfois RMN du 13C. La partie acide a été soumise à une réaction d’estérification ou de réduction avant la séparation des constituants.
Ainsi, près de 170 composés sesquiterpéniques mono- ou polyfonctionnalisés, ont été identifiés. Certains de ces composés possèdent des squelettes originaux et rares tels que prézizaane, zizaane, khusiane, cyclopacamphane, spirovétivane, épi-, seco- et nor- eudesmanes, oppositane…
Parmi les travaux récents, nous pouvons citer les travaux de Delort et Jaquier (2009) sur l’huile essentielle de fruits de Citrus australasica. L’analyse par CPG-SM et RMN du 13C de chaque fraction obtenue après séparation par chromatographies répétitives a permis l’identification de 195 composés dont 4 nouveaux esters menthaniques. Ici et dans de nombreux cas l’individualisation des constituants n’est plus nécessaire. L’enrichissement, combiné à des techniques spectroscopiques tels la RMN du 1H et du 13C, permet une identification des constituants.
De la même manière, nous citerons l’exemple de l’huile essentielle de Cistus creticus ssp. eriocephalus and Cistus creticus ssp. corsicus qui par analyse par CPG-SM et par RMN du 13C de fractions obtenues après des étapes de séparations a permis l’identification de 164 constituants qui représentent 83% de l’huile essentielle globale. Le 13-oxo-15,16-bis-norent- labd-8(17)-ène et du 13-oxo-15,16-bis-nor-ent-labd-7(8)-ène ont été identifié par RMN du 13C et pour la première dans une huile essentielle du genre Cistus (Paolini et al., 2009).
Actuellement cette voie, n’est plus que rarement utilisée. Elle est cependant incontournable pour la caractérisation de nouveaux constituants, mais aussi pour déterminer les composés responsables d’activités biologiques. Nous citerons comme exemple les tests concernant l’activité spasmolytique de l’huile essentielle et l’extrait au solvant (CH2Cl2- MeOH) d’Arracacia tolucensis var. multifida. Le fractionnement « bio-guidé » sur colonne ouverte suivi de test biologique ont permis l’isolation et caractérisation de 4 coumarines dans l’extrait dont 2 sont présentes dans l’huile essentielle (osthol et subérosine). Ainsi, l’activité
de cet extrait serait principalement du à l’isoimpératorine, l’osthol, le subérosine et le 8- méthoxypsoralene mais aussi à une synergie entre ces constituants (Figueroa et al., 2007).
Nous citerons aussi, les travaux d’Adio et König (2005), concernant une huile riche en sesquiterpenes de Plagliochila asplenioides. La combinaison de techniques analytiques chromatographiques (CPG,CPG préparative,CCM) et spectroscopiques (SM,RMN) a permis d’une part de caractériser et d’isoler trois nouveaux sesquiterpènes hydrocarbonés : bisabola- 1,3,5,7(14)-tetraène, bisabola-1,3,5,7-tetraène, et (-)-aromadendra-1(10),3-diène, et quatre nouveaux sesquiterpènes oxygénés (+)-muurolan-4,7-peroxide, (+)-plagiochiline W, (+)- plagiochiline X et ent-4-épi-maaliol. Il a aussi été possible de caractériser un constituant jamais identifié par une source naturelle : le plagio-4,7-peroxide. La complémentarité de ces méthodes a aussi permis d’identifier près de 40 constituants de l’huile essentielle, majoritairement des sesquiterpènes.
Après ce bref tour d’horizon des principales méthodes d’analyses des mélanges complexes naturels, il nous est possible de formuler quelques observations. La voie A, s’illustre par sa rapidité, particulièrement bien adaptée aux analyses de routine et aux composés volatils, notamment dans le domaine des huiles essentielles. La voie B, plus longue, s’adresse à un plus grand nombre de familles chimiques et présente des applications allant des mélanges non volatils (huiles essentielles complexes) jusqu’aux extraits (coumarines, flavonoïdes,…). Elle permet d’utiliser, en tant que de besoin, les données de la RMN pour l’identification des constituants d’un mélange naturel. Une troisième voie, la Voie C, intermédiaire par rapport aux précédentes, fonde l’identification et si besoin la quantification des principaux constituants des mélanges naturels (huiles essentielles, huiles végétales, résines, extraits, …) sur l’étude du spectre de RMN du 13C du mélange, sans séparation préalable. Elle permet de tirer profit des informations fournies par la RMN en supprimant ou tout au moins en diminuant considérablement les étapes de séparation. Cette technique a été développée au Laboratoire et a fait l’objet de divers travaux depuis plusieurs années.