Matière minérale (%) (= teneur en cendre)

Matériels et Méthodes

102

% dans le matras et 25 % d’acide borique dans une fiole de 250 mL. L’ammoniac est récupéré dans une solution d’acide borique. La dernière étape est la titration, elle a été réalisée par l'ajout de quelques gouttes de l’indicateur de TACHIRO (mélange de bleu de méthylène et rouge de méthyle) dans la fiole contenant l'ammoniac et l'acide borique. L’excès d’ammoniac est alors dosé par l’acide sulfurique 0,05 N par simple titration. La teneur en azote total est déterminée par la formule suivante :

N (%) = (Co x 2 x V x 14) / P P (%) = N (%) x 6,25 N : Pourcentage d'azote (%)

P : Pourcentage de protéine (%)

Co:Normalité de l’acide sulfurique (0.05) V : Volume de l’acide sulfurique versé (mL) P : Poids de la prise d’essai (g)

e. Détermination de la teneur en sucre

La teneur en sucre est calculée simplement selon la formule suivante : S (%) = 100 – (H + P + L + M)

H: Humidité (%) (= teneur en eau)

Matériels et Méthodes

103

convenables, 2 mL d’une solution de carbonate de sodium Na2CO₃ (7,5 %) (Sigma Aldrich).

Après 15 min d’incubation au bain marie à 45°C, l’absorbance est mesurée à 765 nm contre un blanc sans extrait. La quantification des polyphénols totaux a été calculée à partir de l’équation de régression de la gamme d’étalonnage établie avec l’acide gallique (0-0,25 μg/mL) dans les mêmes conditions que l’échantillon. Les résultats sont exprimés en mg d’équivalent d’acide gallique par gramme de matière sèche (mg EAG/g MS).

b. Dosage des flavonoïdes

La détermination des flavonoïdes totaux a été effectuée par la méthode colorimétrique de chlorure d’aluminium décrite par Dehpeur (Dehpeur et al., 2009). Pour cela, 500 μL de chaque extrait à analyser sont ajoutés à 1500 μL de méthanol à 95 % (Sigma Aldrich), 100 μL de AlCl3 à 10 % (m/v) (Sigma Aldrich), 100 μL d’acétate de sodium (C2H3NaO2) (Sigma Aldrich), 1 M et 2,8 mL d’eau distillée. Le mélange est agité puis incubé à l’obscurité et à température ambiante pendant 30 min. L’absorbance est mesurée à 415 nm. La concentration des flavonoïdes est déduite à partir d’une gamme d’étalonnage établie avec la quercétine (0- 0.3 μg/mL) et elle est exprimée en milligramme d’équivalent de quercétine par gramme d’extrait (mg EQ/g MS). Afin de quantifier et comparer les flavonoïdes, une droite d’étalonnage (y = ax + b) a été réalisée avec la quercétine dans les mêmes conditions opératoires (concentrations) que les échantillons.

1.4 Potentiels antioxydants des extraits d’arganier a. Test antioxydant par DPPH

Pour étudier l’activité anti-radicalaire de nos différents extraits, nous avons opté pour la méthode qui utilise le diphényl picryl-hydrayl (DPPH) comme un radical libre relativement stable, selon le protocole décrit par (Huang et al., 2011) (Figure 34).

Matériels et Méthodes

104

Dans ce test, les antioxydants réduisent le DPPH ayant une couleur violette en un composé jaune, le DPPH 2,2-diphényl picryl-hydrazine (C18H12N5O6) (Sigma Aldrich), dont l'intensité de la couleur est inversement proportionnelle à la capacité des antioxydants présents dans le milieu. La solution de DPPH est solubilisée dans du méthanol absolu (0,2 mM). 2,5 mL de l’extrait à tester ont été ajoutés à 0,5 mL de la solution de DPPH. Après agitation du mélange par un vortex, les tubes sont placés à l’obscurité, à température ambiante pendant 30 min. La lecture est effectuée par mesure de l’absorbance à 517 nm par spectrophotomètre. Le contrôle négatif contenant uniquement la solution de DPPH. La concentration de DPPH est déduite à partir d’une gamme d’étalonnage établie avec le Trolox (2,5-160 mg/mL).

L'activité anti-radicalaire (AAR) a été calculée en pourcentage de la décoloration du DPPH en solution dans le méthanol.

AAR % = [(Abs 517 contrôle–Abs échantillon 517) / Abs 517 contrôle] x 100 Soit:

AAR: Activité Anti-radicalaire

Abs: Absorbance à la longueur d’onde de 517 nm.

La forme libre du DPPH (diphényl picryl- hydrayl) de couleur violette sera réduite par les antioxydants en DPPH (2,2- diphényl picryl-hydrazine) en couleur jaune.

Figure 35: Structure de DPPH.

Figure 34: Principe du test DPPH.

Matériels et Méthodes

105 b. Pouvoir antioxydant du fer FRAP

Le pouvoir réducteur du fer dans les extraits est déterminé selon la méthode décrite par (Oyaizu et al., 1986). Elle est basée sur la réduction du fer ferrique en fer ferreux par les antioxydants qui donnent la couleur bleue (Figure 35).

1 mL de l'extrait ou du standard Trolox est mélangé avec 2,5 mL d'une solution tampon phosphate 0,2 M (pH 6,6) et 2,5 mL d'une solution de ferricyanure de potassium K3Fe(CN)6 à 1 %. L'ensemble est incubé au bain-marie à 50°C pendant 20 min ensuite, 2,5 mL d'acide trichloracétique à 10 % sont ajoutés pour stopper la réaction. Les tubes sont centrifugés à 1000 g pendant 10 min. 2,5 mL du surnageant sont mélangés avec 2,5 mL d'eau distillée et 0,5 mL d'une solution aqueuse de FeCl3 (Chlorure ferrique) à 0,1 %. La lecture de l'absorbance du milieu réactionnel se fait à 700 nm contre un blanc semblablement préparé, en remplaçant l'extrait par de l'eau distillée qui permet de calibrer l'appareil (spectrophotomètre UV-VIS). La concentration de FRAP est déduite à partir d’une gamme d’étalonnage établie avec la Trolox (2,5-160 mg/mL). Une augmentation de l'absorbance correspond à une augmentation du pouvoir réducteur des extraits testés (Singleton et al., 1965). Le pouvoir réducteur des extraits est représenté en mg Trolox par g de matière sèche (mg Trolox /g MS).

Il est calculé par la réaction suivant :

Pouvoir réducteur de fer (%) = [(Abs700 contrôle – Abs700 échantillon) / Abs700 contrôle]

x 100

Figure 35: Réduction du fer ferrique de couleur jaune par les antioxydants en fer ferreux de couleur bleue (Test FRAP)

Matériels et Méthodes

106 2. Huile d’Argan

2.1 Préparation de l’huile d’argan

L’huile d’argan alimentaire et cosmétique utilisées pour le traitement des cellules et des rats proviennent de deux régions : Berkane (Oujda, Nord-Est du Maroc), Targa (Agadir, Sud-Ouest du Maroc. Elles sont extraites en 2014 à partir des amandes de fruit d’arganier.

L'extraction de l'huile d'argan alimentaire s'effectue d’une manière artisanale traditionnelle à partir des amondons torrifiés, alors que l’huile d’argan cosmétique est extraite à partir des amondons non torrifés (El manfalouti et al., 2010 ; Charrouf and Guillaum, 2007).

a. Récolte des fruits d’argan :

Lorsque les fruits arrivent à maturité, ils sont récoltés par les femmes et les hommes berbères dans les arganeraies ; souvent c’est toute la population du village qui y participe. Les fruits sont ensuite séchés au soleil pour faciliter la prochaine étape de production traditionnelle.

b. Extraction traditionnelle :

L'extraction de l'huile d'argan est réalisée par les femmes d'une manière très artisanale.

Quand les fruits sont mûrs, ils sont soigneusement débarrassés de leur pulpe (dépulpage), cette dernière est mise au rebut. Les noyaux sont écrasés manuellement par les femmes à l'aide des pierres tout en les tenant entre le pouce et l’index (concassage). Les amandes ainsi séchées, sont ensuite torréfiées dans des plats en terre chauffés sur un feu doux (Figure 36).

Les amandes grillées sont refroidies et moulues à l’aide d’une meule manuelle (trituration), donnant une pâte onctueuse de couleur brune, qui est malaxée avec de l'eau chaude pendant plusieurs minutes (malaxage). La pâte est ensuite pressée avec les mains

Figure 36: Etapes d’extraction traditionnelle de l’huile d’argan

A: Dépulpage des fruits, B: Concassage des noix, C: Torréfaction traditionnelle