RT-qPCR

11.1 Extraction d’ARN

L’extraction des ARN totaux a été réalisée avec le Kit « RNeasy Mini Kit (250) » (Qiagen). Après 24 h de traitement, les cellules ont été trypsinées, lavées avec du PBS puis 600 μL de tampon de lyse RLT (RNA lysis Tissus) et 1 % de β–mercaptoéthanol ont été ajoutés. Ce tampon contient des sels de guanidium qui sont hautement dénaturants et qui, avec l’aide du β- mercaptoéthanol, permettent la lyse des cellules ainsi que l’inactivation des

Matériels et Méthodes

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RNases. Les lysats cellulaires ont été transférés dans des tubes Eppendorfs où un volume de 600 μL d’éthanol à 70 % a été ajouté.

Les lysats ont été transférés par la suite sur colonne « RNeasy Mini Spin » (Qiagen) où les ARN sont retenus par la membrane de silice. Deux lavages des colonnes ont été effectués avec le tampon RW1 (RNA Wash Buffer 1). La DNase l (« RNase-free DNase Set » Qiagen) a ensuite été déposée dans chaque colonne pendant 15 min à température ambiante afin de digérer l’ADN génomique. Deux nouveaux lavages ont été réalisés avec le tampon RPE (RNA Buffer Ethanol), avec des centrifugations de 30 secondes à 8000 g pour laver la colonne. La colonne est ensuite séchée par une centrifugation de 1 min à 12 000g puis cette dernière est placée dans un nouveau tube Eppendorf. Un volume de 30 µL d’eau ultrapure (DNAse et RNAse free (Qiagen)) est ajouté dans la colonne puis une centrifugation d’une minute à 8 000 g permet de récupérer les ARN totaux. Les ARN peuvent alors être congelés à -20°C.

11.2 Dosage des ARN

Le dosage des ARN totaux a été réalisé en utilisant un spectrophotomètre par lecture de la densité optique (DO) à 260 nm avant de procéder à la RT-qPCR. 2 µL d’échantillons sont placés sur le dispositif TrayCell (Hellma) et la densité optique est lue à 260 et 280 nm par le spectrophotomètre (UV-1800, Shimadzu). Les concentrations ont été calculées sachant qu’une unité de DO à 260 nm correspond à 40 μg/mL d’ARN. Le rapport DO260/DO280 doit être compris entre 1,80 et 2,2 unités d’absorbance car en dessous de 1,80, une contamination protéique est à redouter, alors qu’au-dessus de 2, c’est l’ADN génomique qui risque d’être le contaminant. La valeur de la DO à 260 nm permet de calculer la concentration en ARN de l’échantillon avec le logiciel UVProbe (Shimadzu).

11.3 RT-PCR: Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction

La RT-PCR a été effectuée à l’aide du Kit « i Script CDNA Synthesis » (Biorad), dans un thermocycleur « PTC- 100, Programmable Thermal Controller ». Des ADN complémentaires ont été synthétisés à partir des ARN totaux de nos échantillons par l’action d’une polymérase (appelée Reverse Transcriptase) qui utilise de l’ARN comme matrice. Les échantillons d’origine qui ont été dosés sont tous ajustés à la même concentration de 1 µg/mL dans un volume de 30 µL d’eau stérile. Pour chaque condition, on a: 1 µg d’ARN, 4 µL de 5X iScript react mix, 1 µL de iScript Reverse Transcriptase et 14 µL d’eau. Le volume final est de 20 µL. Les échantillons sont alors chauffés 5 min à 25°C puis 1 h à 42°C (température de

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réaction de la RT) et 5 min à 95°C (destruction de l’enzyme). Les ARN sont alors rétro- transcrits en ADNc et peuvent être stockés à -20°C.

11.4 qPCR: Quantitative Polymerase Chain Reaction

La PCR quantitative (qPCR) ou PCR en temps réel a été effectuée à l’aide du kit « Mesa green qPCR MasterMix Plus » (Eurogentec), dans un thermocycleur Step One Plus (AB Applied Biosystems). La qPCR est une réaction de PCR classique visant à amplifier spécifiquement un ADN particulier, dans le but de quantifier par fluorescence la formation du produit de PCR. Le fluorophore utilisé a été le MESA green, un agent intercalant des acides nucléiques doubles brins qui se fixe au niveau du petit sillon, et qui est capable d’émettre de la fluorescence dans le vert lorsqu’il est excité en UV. La fluorescence émise est proportionnelle à la quantité de MESA green fixé, donc à la quantité d’ADN dans l’échantillon. Le but de la PCR quantitative est de quantifier le niveau d’expression d’un gène donné en amplifiant les ADNc issus des ARNm par une réaction de PCR.

Pour cela, les échantillons obtenus par la RT sont tous dilués préalablement en ajoutant 80 µL d’eau aux 20 µL d’ADNc d’origine. Un volume de 25 µL de chaque échantillon est alors ajouté dans un même tube afin de réaliser plus tard la gamme standard.

Un nouveau volume de 225 µL d’eau est ensuite ajouté aux 75 restants pour obtenir un volume final d’échantillon de 300 µL. La technique de qPCR est faite en plaque 96 puits dans laquelle 20 μL de mix de qPCR et 5 μL d’ADNc dilué sont introduits. Le mix de qPCR est préparé à partir du Mesa green, les dNTPs, et d’autres éléments nécessaires à la réaction comme le MgCl₂, auxquels sont ajoutées des amorces sens et anti-sens spécifiques du gène d’intérêt (300 nM final chacune), et de l’eau stérile, soit 0,075 µL d’amorce sens (100 µM), 0,075 µL d’amorce anti-sens (100 µM), 7,35 µL d’eau et 5 µL d’échantillon.

Le gène de la protéine ribosomale 36b-4 a été choisi comme gène de référence lors de la qPCR. En effet, l’expression de ce gène n’est pas modifiée par les différents traitements appliqués aux cellules. Les amorces de qPCR sont choisies à partir des indications obtenues sur le site Primer Bank, pour les gènes 36b-4, PPAR-α, Acox-1, Abcd-3, Abcd-1 et Mfp-2.

Les séquences sont résumées dans le Tableau 10.

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Tableau 10: Séquences des différentes amorces utilisées pour les qPCR

La plaque 96 puits est centrifugée (1 min à 1000 g) puis insérée dans le thermocycleur (Step One Plus Real-Time, PCR système)

Le programme utilisé comprend trois étapes: une première phase 30 s à 25°C, une seconde phase d’activation de l’enzyme 2 min à 95°C, et une troisième phase elle-même découpée en 3 étapes : dénaturation des acides nucléiques 30 s à 94°C, hybridation avec les amorces 30 s à 60°C et élongation 30 s à 72°C. Cette dernière phase est répétée sur 40 cycles.

La fluorescence est mesurée à chaque fin de phase d’élongation, nous obtenons donc une courbe de fluorescence comprenant trois phases : la phase d’initiation durant laquelle la quantité de produit de PCR est trop faible pour être mesurée ce qui correspond au bruit de fond, la phase exponentielle durant laquelle, en théorie, le nombre de produit de PCR, est doublé à chaque cycle, et la phase plateau où la fluorescence obtenue a atteint son maximum.

A la fin des 40 cycles de PCR, une étape, supplémentaire est effectuée afin de vérifier la spécificité du produit amplifié et la présence d’éventuels contaminants. Elle permet d’établir une courbe de fusion.

11.5 Analyse des résultats de qPCR

Les courbes de fluorescence obtenues ont été analysées avec le logiciel « Step One Software » ce qui nous permet de déterminer les cycles seuil (Thershold Cycle, Ct), cycle auquel la fluorescence commence à être suffisante pour être quantifiée. Le Ct correspond au nombre de cycles de qPCR nécessaires pour atteindre une certaine valeur de fluorescence, appelée seuil, fixée pour tous les échantillons. Le gène 36b4 a été utilisé comme gène de normalisation, il a été sélectionné comme étant le plus stable pour les traitements. Pour chaque échantillon, nous obtenons un Ct. Le ΔCt qui correspond à la différence entre le Ct du traité et le Ct du témoin a été calculé : plus la différence est importante, plus le traitement a un

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impact sur la transcription. Les résultats d’expression relative de notre gène par rapport au gène de normalisation sont ensuite représentés sous forme de graphisme grâce au logiciel.

III. MODELE ANIMAL