DEMARCHE SCIENTIFIQUE ET PRINCIPAUX RESULTATS
1. Optimisation du protocole de dosage des phénoloxydases chez Crassostrea gigas
1.1. L’approche cinétique
La première étape d’optimisation du protocole de dosage des PO chez C. gigas a consisté à vérifier que la mesure d’activité correspondait bien à une phase de la cinétique où l’enzyme travaillait en conditions de vitesse initiale. En effet, le protocole de dosage, qui a permis de mettre en évidence la présence d’une activité de type PO chez C. gigas, se basait sur une analyse spectrophotométrique en point final (Hellio et al. 2007).
Cependant, la quantité de produit formé à un temps t (dosage discontinu) ne permet pas toujours de refléter la concentration en enzyme réelle. Il peut arriver qu’à une concentration d’enzyme plus importante, la réaction se réalise dans sa totalité ou atteint l’équilibre durant le temps utilisé pour le dosage. Dans ce cas, l’ajout d’enzyme supplémentaire n’engendrera pas une augmentation de la formation de produit, entraînant par conséquent, une potentielle sous-estimation de l’activité enzymatique (Pelmont 1995). En revanche, lorsque l’on réalise des analyses cinétiques en réalisant un dosage continu dans le temps, en vitesse initiale de réaction, le nombre de molécules de produit formé (ou de substrat disparu) en fonction du temps sera proportionnel à la concentration en enzyme.
Ainsi, il nous semblait opportun de procéder à une phase d’optimisation du dosage par la mise en œuvre de cinétiques témoins dans l’objectif de fixer les conditions optimales de cette catalyse. Ce type d’analyse a permis de diminuer les temps d’analyse par rapport à ce que pouvait rapporter la littérature : la mesure en point final était réalisée après que la réaction ait atteint l’équilibre, c’est-à-dire 21h après l’initiation de la réaction (Hellio et al.
2007). La méthode optimisée du dosage utilise le même substrat mais s’effectue désormais sur un temps de mesure de 5h, durée optimale autorisant le calcul de l’activité
enzymatique. Le protocole expérimental détaillé utilisé au cours de cette thèse pour l’ensemble des mesures d’activités enzymatiques PO est présenté en Annexe 1.
D’autre part, l’oxydation catalysée par les PO nécessite la présence d’O2 et les substrats des PO sont rapidement autooxydés, c’est-à-dire oxydés en absence de l’enzyme, en contact avec l’air. Cette autooxydation conduit, de la même façon qu’en présence de PO, à la formation de quinones. De ce fait, il est important de réaliser aussi des analyses cinétiques contrôles en absence d’enzymes et en présence du seul substrat de la réaction.
Les valeurs d’autooxydation ainsi obtenues devront être prises en compte pour le calcul final de l’activité enzymatique des échantillons.
1.2. Les inhibiteurs de protéases et leur interférence avec le dosage
Des inhibiteurs de protéases sont souvent ajoutés à l’échantillon où se trouvent les protéines d’intérêt, ceci afin d’éviter leur dégradation endogène. Cependant, parmi les inhibiteurs de protéases classiquement utilisés pour protéger les échantillons de leur dégradation, le fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) exerce un effet inhibiteur sur l’activité PO, et de ce fait tous les cocktails d’inhibiteurs dans lesquels le PMSF est présent doivent être proscrits (Aladaileh et al. 2007a). Le choix de ne pas utiliser d’inhibiteurs de protéases a donc été fait dans le cadre de cette thèse et dans l’objectif de pallier à une éventuelle dégradation des protéines de l’échantillon, l’ensemble des expériences préliminaires aux dosages a été conduite à une température ≤ 4°C.
1.3. Le choix du tampon
La composition du tampon est également très importante pour la mesure de l’activité enzymatique d’intérêt. Le tampon CAC 0,01 M, utilisé pour doser l’activité PO dans le protocole de Hellio et al. (2007), contient du citrate de trisodium, connu comme étant un inhibiteur des PO (Montero et al. 2001a, b). Dans un premier temps, le dosage a été réalisé avec du plasma de C. gigas et le substrat L-DOPA, en utilisant le protocole de dosage décrit en Annexe 1. Nous avons testé le tampon CAC, avec ou sans citrate de trisodium. Après avoir confirmé l’effet inhibiteur du citrate de trisodium, nous avons testé différents tampons (Figure 22):
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• tampon PBS 0,1 M, pH 7,0 (0,2 M de phosphate de sodium monobasique NaHPO4, 0,2 M de phosphate de sodium dibasique Na2HPO4, 150 mM de chlorure de sodium NaCl) (Maruyama et al. 1991) ;
• tampon Tris HCl 0,1 M, pH 7,0 (0,1 M d’hydrochlorure de tris(hydroxyméthyl)aminométhane) (Cong et al. 2005).
0 0,1 0,2 0,3 0,4
0 2 4 6 8 10
Vi (∆ A.min-1.10-3)
Concentration finale L-DOPA (mM)
CAC + citrate + sels
CAC - citrate + sels
CAC - citrate - sels
Tris HCl 0.1 M - citrate + sels
Tris HCl 0.1 M - citrate - sels
PBS (potassium) 0.1 M - citrate - sels
0,8 0,6 0,4 0,2 0
CAC + citrate + sels
CAC – citrate + sels CAC – citrate – sels
Tris HCl 0,1 M – citrate + sels Tris HCl 0,1 M – citrate – sels PBS 0,1 M – citrate - sels
(∆ A.min-1.10-3)
*
*
*
*
*
*
Figure 22 Effet de la nature du tampon sur l’activité PO. PBS à 0,1 M, pH 7,0 (tampon phosphate salin : 0,2 M de NaHPO4 (phosphate de sodium monobasique), 0,2 M de Na2HPO4 (phosphate de sodium dibasique), 150 mM de NaCl (chlorure de sodium) ; CAC, pH 7,0 : 10 mM cacodylate de sodium; citrate : 100 mM citrate de trisodium ; sels : 450 mM de NaCl (chlorure de sodium), 26 mM de MgCl2 (chlorure de magnésium), 10 mM de CaCl2
(chlorure de calcium) ; Tris HCl 0,1 M, pH 7,0. Parallèlement, différentes concentrations en L-DOPA (0, 1, 2, 2,5, 3, 5, 10 mM) ont été testées afin de déterminer la concentration saturante en substrat à utiliser pour le dosage de la PO. Les expériences ont été réalisées à 25°C. Une unité d’activité enzymatique correspond à une augmentation d’absorbance de 0,001 par minute (Cong et al. 2005). Moyenne ± ET Δ A.min-1.10-3, n = 9 (trois réplicas de mesure sur trois pools d’hémolymphe différents, chaque pool étant constitué de 10 huîtres).
*différence significative entre au moins deux conditions (tampons) pour p < 0,05.
Pour les tampons pour lesquels nous avons observé une activité de type PO plus élevée en comparaison aux autres tampons (tampon CAC et tampon Tris HCl), nous avons testé deux conditions : en ajoutant des sels (0,45 M de chlorure de sodium, NaCl, 26 mM de chlorure de magnésium, MgCl2, 10 mM de chlorure de sodium, CaCl2) au tampon ou non.
Les activités enzymatiques ont été calculées en se basant sur la définition suivante : une unité d’activité enzymatique PO correspond à une augmentation de l’absorbance de 0,001
par minute (A490.10-3.min-1 ; Cong et al. 2005). Puis, les moyennes et écart-types (ET) de ces activités enzymatiques ont été calculés par la suite. Les résultats obtenus avec ces différents tampons ont montré que le tampon Tris HCl 0,1 M contenant des sels était le plus approprié pour doser l’activité PO chez cet organisme (Figure 22 ; Tableau 11).
1.4. La définition de l’activité enzymatique et de l’unité d’activité enzymatique spécifique
Il existe, à notre connaissance, deux façons de définir une unité d’activité enzymatique PO. En effet, une unité d’activité enzymatique PO peut correspondre à :
• Une augmentation d’absorbance de 0,001 par minute (Cong et al. 2005) comme définit précédemment ;
• L’apparition d’une µmole de produit par minute (Pomerantz 1963).
Nous avons choisit pour la suite de notre étude d’utiliser la deuxième définition, car dans notre cas, nous avons travaillé avec différents substrats et que de ce fait, les produits issus des réactions d’oxydation catalysées par les PO ont des propriétés d’absorption différentes entre eux. Puis, dans le but de pouvoir comparer différents échantillons pour une même expérience, et entre différentes expériences, nous avons choisi de présenter nos résultats toujours par rapport à la quantité de protéines totales présentes dans l’échantillon.
Tableau 11 Récapitulatif des paramètres étudiés pour optimiser le protocole de dosage des activités phénoloxydase chez Crassostrea gigas.
Paramètres Ancien protocole
(Hellio et al. 2007)
Nouveau protocole (Luna-Acosta et al. 2010a)
Type d’analyse Point final Cinétique
Temps de réaction
(avec L-DOPA) 21h 5h
Tampon
CAC contenant 100 mM de citrate de trisodium (inhibiteur des PO) et des sels (0,45 M NaCl, 26 mM MgCl2, 10 mM CaCl2)
Tris HCl 0,1 M, pH, 7,0, contenant des sels (0,45 M NaCl,
26 mM MgCl2, 10 mM CaCl2) Définition de
l’activité enzymatique
Augmentation de l’absorbance de 0,001 par minute (Cong et al. 2005)
Quantité d’enzyme capable de catalyser la production d’une µmole de produit par
minute (Pomerantz 1963) Unité d’activité
enzymatique utilisée A490
1 µmole.min-1.mg prot-1 (Activité spécifique)
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