Résultats résumés et conclusions

Nous montrons dans cet article que la première exposition à la cocaïne induit bien une augmentation de la densité en épines au sein des SPN du Shell du NAc s’accompagnant d’une augmentation de la densité en contacts synaptiques glutamatergiques. Cet effet est d’autant plus fort lorsque l’on sélectionne les neurones activés par la cocaïne à l’aide d’un immunomarquage de cFos, montrant indirectement un effet préférentiel dans les SPN activés par la cocaïne, et exprimant les D1R (Bertran-Gonzalez et al., 2008). Ces remaniements synaptiques semblent stables puisque l’effet est visible même une semaine après l’injection de cocaïne. Cette plasticité est spécifique du NAc puisqu’elle n’a pas été retrouvée dans le striatum dorso-médian.

De façon similaire à ce que nous avions observé après des administrations chroniques de cocaïne, ces expériences montrent que la densité en boutons présynaptiques VGLUT1^venus n’est pas altérée par une injection aigüe de cocaïne, et que le nombre de boutons connectés à deux épines dendritiques est augmenté. Ainsi le mode de formation de ces nouvelles synapses correspond à des épines néoformées connectant des boutons présynaptiques préexistants.

Afin d’observer la formation de ces épines en temps réel, j’ai mis en place et optimisé un modèle de tranches de striatum stimulées ex vivo par des agents permettant de reproduire les effets de la cocaïne in vivo. J’ai choisi pour cela une co-stimulation pharmacologique à l’aide d’un agoniste des récepteurs D1 (le SKF 38393) et d’une faible dose de glutamate qui avait été mise au point au laboratoire sur culture primaire de neurones striataux (Pascoli et al., 2011). J’ai vérifié que cette co-stimulation permettait de reproduire sur les SPN du NAc 1) l’activation de la voie des ERK ; 2) la formation d’épines dendritiques, une heure après la stimulation.

Ayant validé le modèle, l’étude a été poursuivie en temps réel en microscopie à deux photons. Pour cela, il nous fallait réaliser un marquage des SPN-D1 in vivo, avant la réalisation des tranches. Nous avons choisi des infections virales intra-NAc, à l’aide d’une forte dose d’AAV exprimant la td-Tomato « flex » et un faible titre d’AAV exprimant la Cre- recombinase sous le contrôle du promoteur de la substance-P, spécifique des SPN-D1 (Yagishita et al., 2014). La co-stimulation SKF-glutamate induit effectivement une augmentation de la fréquence de formation des épines sur les D1-SPN, dès 25 minutes après le début de la stimulation. Chez les souris VGLUT1^venus, cette co-stimulation permet

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d’observer la formation de contacts des boutons présynaptiques avec les épines néoformées.

En accord avec les résultats obtenus in vivo, ce contact existe pour 60% des nouvelles épines, et correspond à des boutons pré-synaptiques pré-existants.

Un des objectifs de cette thèse était d’élucider des signatures moléculaires des différentes phases de formation des épines par la cocaïne : la pousse et le maintien. Les études pharmacologiques ont tout d’abord été réalisées sur des tranches ex vivo fixées 1 heure après le début de la co-stimulation SKF-Glu. L’inhibition pharmacologique des voies ERK (U0126) et mTOR (rapamycine) bloque totalement les épines néo-formées une heure après la co- stimulation. Une cible cellulaire commune des voies ERK et mTOR pouvait être les voies de synthèse protéique dépendantes du complexe Eukaryotic Initiation Factors (eiFs). L’initiation de la traduction protéique requiert l’association de ce complexe à l’ARNm, par des processus nécessitant des phosphorylations dépendantes des kinases mTOR et MNK-1 (MAP Kinase Interacting Kinase) une cible cytoplasmique de ERK (Bhakar et al., 2012).

Par immunocytochimie, nous montrons que MNK-1 est activée ex vivo, phosphorylée, dans le NAc après co-stimulation. L’inhibition de l’activité de MNK-1 par le CGP 57380 bloque totalement la formation de nouvelles épines induites par la co-stimulation.

Ces résultats nous ont amené à étudier les rôles respectifs de ERK1/2, MNK-1, ainsi que de la traduction locale et la transcription dans les différentes phases de spinogénèse. Pour cela, nous avons utilisé les tranches stimulées ex vivo, et suivi la formation des épines sur les SPN-D1 en microscopie à 2 photons, jusqu’à 1h30 après leur apparition. En présence de l’inhibiteur pharmacologique de la voie ERK1/2 (U0126), nous montrons une absence totale de pousse d’épine. De tels résultats ne sont pas observés avec les inhibiteurs de MNK-1 (CGP 57380), de la traduction (anisomycine), ou de la transcription (actinomycine). L’analyse détaillée de la durée de vie des épines néoformées met en évidence des données originales, puisque l’inhibiteur de MNK-1, perturbe de façon importante la stabilité de ces épines au cours du temps. L’inhibition globale de la traduction, et non de la transcription, produit le même effet.

Ainsi, dans l’ensemble, ces résultats permettent de conclure que la voie des ERK joue un rôle fondamental et complexe dans la régulation de la plasticité structurale des SPN-D1 du NAc en 1) initiant la pousse des épines via l’activité de ERK1/2 et 2) en stabilisant ces épines nouvellement formées via une synthèse de nouvelles protéines initiée par l’activité de MNK1.

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Enfin, nous avons validé l’ensemble de ces données, in vivo, chez la souris.

L’inhibiteur de MNK-1, infusé par voie stéréotaxique dans le NAc avant l’administration aiguë de cocaïne, bloque totalement la spinogénèse induite après une heure et son maintien à 24H.

L’ensemble de ces résultats nous a permis de valider un mode de formation des nouvelles synapses glutamatergiques induite par une injection unique de cocaïne, dépendant de contacts avec des boutons pré-synaptiques pré-existants. Ils mettent en évidence le rôle crucial et les mécanismes d’action de la voie ERK dans cette plasticité structurale.

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DISCUSSION ET PERSPECTIVES

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