M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, 117997 Moscow, Russia
Transforming growth factor‑beta (TGF‑β) is a ubiquitous cytokine that control many fundamental aspects of cellular behavior, including proliferation, differentiation, adhesion and apoptosis. Changes in the level of TGF‑β production by cells could lead to the development of hyperproliferative diseases, such as fibrosis and cancer.
We have developed a technology for production of the of human TGF‑β1 monomers expressed in E. coli strain BL21(DE3). The DNA sequence encoding the human TGF‑β1 was synthesized and cloned into plasmid pET‑32a downstream to the gene of fusion partner thioredoxin immediately after the DNA sequence encoding enteropeptidase recognition site. The monomer of TGF‑β1 was obtained by substitution of the cysteine 77 forming intermolecular disulfide bond in dimer to a serine (Ser) by site‑directed mutagenesis. After renaturation the Trx/TGFβ1/С77S fusion was cleaved by recombi- nant human enteropeptidase light chain and purified by affinity chromatography using Affi‑gel 15 con- jugated with recombinant protein extracellular domain of TGF‑β1 type II receptor (TBRII). Protein yield was about 10‑14 mg from 1 liter cell culture. In sandwich ELISA monomeric TGF‑β1 demon- strated binding affinity to soluble type II receptor comparable to the commercially available dimeric TGF‑β1 expressed in CHO cells. Monomer TGF‑β1 inhibited proliferation of mink lung epithelial (Mv1Lu) with an effective dose of 20 ng/ml, which was two orders of magnitude higher in comparison to dimeric protein (ED50 = 0,05 ng/ml). Based on the results of ELISA and analysis of cell prolifera- tion assays of Mv1Lu cells we hypothesized that the monomers of TGF‑β1 at concentrations above 2.5 ng/ml is capable to form non‑covalent dimers on the surface of receptor TBRII. Thus, the prepara- tion of monomeric TGF‑β1 can be used in diagnostic for determination of protein concentration in the blood, as well as for therapy of hyperproliferative diseases.
ИЗУЧЕНИЕ ПРОДУКцИИ ОКСИДА АЗОТА В ТКАНяХ СЕРДцА ЖИВОТНЫХ ПРИ ГИПОКСИИ В ПРИСУТСТВИИ ДОНОРА И ИНГИБИТОРА СИНТЕЗА ОКСИДА АЗОТА Куроптева З.В.1, Байдер Л.М.1, Белая О.Л.2, Крушинский А.Л.3, Кузенков В.С.3, Реутов В.П.4
1Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, 119334 Москва, ул.Косыгина, 4
2Московский государственный медико-стоматологический университет, 127473 Москва, ул. Делегатская, 20/1
3Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, 119992 Москва, Ленинские горы
4Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, 117485 Москва, ул. Бутлерова, 5а
e-mail: zvk@sky.chph.ras.ru
Методом ЭПР исследованы изменения содержания оксида азота в тканях сердца животных при гипобарической гипоксии на начальных этапах, сразу после прекращения действия гипок- сии как отдельно, так и в присутствии нитрита натрия, как дополнительного источника окси- да азота, и нитроаргинина (L‑NNA), ингибитора синтеза оксида азота с участием NO‑синтаз.
Исследования проводили на крысах линии Крушинского‑Молодкиной. Было поставлено 7 серий экспериментов по 6 животных в каждом эксперименте: 1 – контроль, при котором животным
внутрибрюшинно вводили физиологический раствор; 2 – гипоксия – в барокамере, имитирую- щей “подъем животных” на высоту 5000 м, при которой животным внутрибрюшинно вводили физиологический раствор; 3 – опыт с введением L‑NNA в физиологическом растворе (в дозе 2,5 мг на 100 г массы тела вводили внутрибрюшинно); 4 – опыт с введением L‑NNA в физиологиче- ском растворе + гипоксия; 5 – опыт с введение NaNO2 в физиологическом растворе (в дозе 0,5мг на 100г массы тела); 6 – опыт с введением NaNO2 в физиологическом растворе + гипоксия; 7 – опыт с сочетанным введением NaNO2 + L‑NNA в физиологическом растворе + гипоксия.
Получены данные, которые показали, что при гипоксии, созданной «подъемом на высо- ту 5000 м», в организме животных наблюдается дополнительное образование оксида азота.
Введение нитрита натрия, как донора оксида азота, также приводило к увеличению содержа- ния NO в условиях гипоксии, по сравнению с введением нитрита натрия отдельно. Ингибитор NO‑синтаз – нитроаргинин, в условиях гипоксии не ингибирует образование оксида азота.
Предполагается, что в условиях гипоксии он сам, как обычное нитросоединение, подвергается восстановительной биотрансформации и становится дополнительным источником NO в орга- низме.
STUDY OF NITRIC OXIDE PRODUCTION BY HYPOXIA BASED IN ANIMAL HEART TISSUES AT PRESENCE OF DONOR AND INHIBITOR OF NITRIC OXIDE SYNTHESIS Kuropteva Z.V.1, Baider L.M.1, Belaia O.L.2, L. Krushinskii L.A.3 V.S. Kuzenkov V.S.3, Reutov V.P.4
1Emanuel Institute of Biochemical Physics RAS, ul. Kosygina 4, Moscow, 119334 Russia
2Moscow state medical stomatological university, ul. Delegatskaia 20/1, Moscow, 127473 Russia
3Departament of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskie Gory 1/12, Moscow, 119991 Russia
4Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, RAS, ul. Butlerova 5a, Moscow, 117485 Russia
It was studied by ESR technique changes in the relative content of nitric oxide in the heart tissues of animals in hypobaric hypoxia (at the initial stages, immediately after the cessation of hypoxia) both separately and in the presence of sodium nitrite, an additional source of nitric oxide, and nitroarginine (L‑NNA), an inhibitor of nitric oxide synthesis by NO synthases.
In this study we used male Krushinsky–Molodkina rats 5–6 months old weighing 280–320 g. We performed seven series of experiments (six animals in each experiment): 1–control (animals were intraperitoneally injected with saline); 2–experiment with placing animals that were intraperitone- ally injected with saline to an altitude of 5000 m (pressure chamber hypoxia); 3–experiment with the injection of L‑NNA in saline; 4–experiment with the injection of L‑NNA in saline + hypoxia; 5–ex- periment with the injection of NaN02 in saline; 6–experiment with the injection of NaN02 in saline + hypoxia; and 7– experiment with combined injection of NaN02 + L‑NNA in saline + hypoxia. Sodium nitrite at a dose of 0.5 mg per 100 g body weight and L‑NNA at a dose of 2.5 mg per 100 g of body weight were injected intraperitoneally. In other series of experiments, L‑NNA at a dose of 2.5 mg per 100 g of body weight was simultaneously injected with sodium nitrite at a dose of 0.5 mg per 100 g of body.
Data obtained show that hypoxia results in additional formation of nitric oxide in the body. Sodium nitrite, a nitric oxide donor, also increases the levels of NO during hypoxia. The NO‑synthase inhibi- tor nitroarginine does not inhibit the formation of nitric oxide under hypoxic conditions: the level of
sodium nitrite alone. It is assumed that, under hypoxic conditions, nitroarginine undergoes biotrans- formation as a common nitro compound and becomes an additional source of NO in the body.
МОЛЕКУЛяРНЫЙ МЕТОД ИДЕНТИФИКАцИИ ВОЗБУДИТЕЛя ТУБЕРКУЛЕЗА, АНАЛИЗА ЕГО ПАТОГЕННОСТИ И ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ
Лейнсоо А.Т., Зименков Д.В., Кулагина Е.В., Антонова О.В., Грядунов Д.А.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32
За последнее пятилетие в РФ отмечен резкий рост туберкулеза (ТБ), обладающего не толь- ко множественной (МЛУ), но и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) – формы ТБ, устойчивого к изониазиду и рифампицину, а также к любому фторхинолону, и, как минимум, к одному из трех инъекционных противотуберкулезных препаратов второй линии терапии (ами- кацин, канамицин или капреомицин). В мире ежегодный прирост случаев ШЛУ ТБ оценивается не менее, чем в 25 000, и почти все они приводят к смертельному исходу.
Для быстрого обнаружения МЛУ и ШЛУ туберкулеза разработан молекулярный метод на основе оригинальной российской технологии гидрогелевых биологических микрочипов (www.
biochip.ru).
Микрочип содержит иммобилизованные олигонуклеотидные зонды, последовательности ко- торых специфичны фрагменту инсерционного элемента IS6110, характерного для микобактерий туберкулезного комплекса, однонуклеотидным полиморфизмам, устанавливающим принадлеж- ность возбудителя туберкулеза к эндемичным для территории РФ семействам Beijing, Haarlem, LAM, Ural, характеризующихся различной патогенностью, а также мутантным вариантам генов rpoB, katG, inhA, ahpC, gyrA, gyrB, rrs, eis, embB, являющихся маркерами лекарственной устой- чивости Mycobacterium tuberculosis.
Процедура анализа включает мультиплексную амплификацию и флуоресцентное мече- ние исследуемых фрагментов микобактериального генома с последующей гибридизацией ПЦР‑продуктов на микрочипе. Методика позволяет выявлять, суммарно, 104 генетических детерминанты устойчивости к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, аминогликозидам/
капреомицину и этамбутолу. Внедрение разработанного метода в клиническую практику по- зволит своевременно назначать адекватную терапию, корректировать её в процессе лечения, а также предотвращать распространение особо опасных форм M. tuberculosis.
MOLECULAR ASSAY FOR IDENTIFICATION OF TUBERCULOSIS CAUSATIVE AGENT, ANALYSIS OF ITS PATHOGENICITY AND DRUG SUSCEPTIBILITY TESTING
A.T. Leinsoo, D.V. Zimenkov, E.V. Kulagina, O.V. Antonova, D.A. Gryadunov Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences,
119991, Vavilova st. 32, Moscow, Russia
Over the past five years, a number of Multidrug‑Resistance and Extensively Drug‑Resistant tuber- culosis (MDR and XDR TB, correspondingly) cases in Russia increased drastically. XDR‑TB is de- fined as TB that has developed resistance to at least rifampin and isoniazid, as well as to any member of the fluoroquinolones and at least one of the following second‑line anti‑TB injectable drugs: kana- mycin, capreomycin, or amikacin. Annual growth of XDR TB cases estimated as 25 000 worldwide and almost all of them cause death.
A molecular assay based on original Russian technology of hydrogel microarrays (biochips, www.
biochip.ru) has been developed for fast identification of multidrug‑resistant (MDR) and XDR tuber- culosis.
The microarray contains immobilized oligonucleotides based on the corresponding sequences of IS6110 region that is typical for Mycobacterium tuberculosis complex, the sequences of single nucle- otide polymorphisms that identify endemic Russian TB genotypes such as Beijing, Haarlem, LAM, Ural which differ from each other by their pathogenicity, and also the sequences of rpoB, katG, inhA, ahpC, gyrA, gyrB, rrs, eis, embB genes with the mutations that act as markers for identification MDR and XDR TB.
The procedure includes multiplex amplification of analyzed fragments of mycobacterial genome with simultaneous fluorescent labeling of PCR‑products followed by hybridization on the developed microarray. The assay allows one to identify 104 genetic determinants of TB resistance to rifampin, isoniazid, fluoroquinolones, aminoglycosides/capreomycin and ethambutol. The application of the developed method in clinical practice will lead to the coincident medication of tuberculosis with the timely therapeutic correction and will promote prevention of the expansion of extensively drug resis- tant M. tuberculosis strains.
РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕСС-ТЕСТА ДЛя ОцЕНКИ КОЛОНИЗАцИОННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА
Несчисляев В.А.1, Столбова М.Г.1, Раев А.Б.2
1ФГУП «НПО «Микроген» МЗРФ «Пермское НПО «Биомед»,г.Пермь, ул.Братская, 177;
2МУЗ МСЧ №9 им. Тверье М.А., г.Пермь, ул.Братьев Игнатовых, 2.
Лактобактерии занимают доминирующее положение в составе нормального вагинально- го микробиоценоза, обеспечивая колонизационную резистентность данного биотопа за счет проявления антагонистической активности, в том числе в отношении патогенной и условно‑
патогенной микрофлоры. Снижение количества лактобактерий вызывает развитие дисбиоза ва- гинального биотопа.
Учитывая то, что традиционный культуральный метод диагностики является трудоемким и продолжительным, представляется целесообразной разработка и внедрение экспресс‑метода диагностики дисбиотических состояний влагалища, связанных с элиминацией лактобактерий и снижением колонизационной резистентности биотопа.
Разработанный метод оценки колонизационной резистентности основан на количественном определении in vitro антагонистической активности выделенной смешанной вагинальной куль- туры, влияющей на биолюминесценцию культуры генномодифицированной Escherichia coli со встроенным геном свечения при кратковременной 2‑часовой совместной экспозиции.
Измерительный прибор для регистрации свечения тест‑штамма – люминометр серии
«Биотокс» – позволяет автоматически вычислить индекс антагонистической активности, коли- чественно равный проценту подавления свечения по сравнению с исходным уровнем. Низкая величина индекса (<50%) свидетельствует о снижении антагонистической активности и коли- чества лактобактерий в составе вагинальной микрофлоры, и, следовательно, колонизационной резистентности биотопа. На основании полученных результатов можно сделать вывод о нали- чии дисбиоза вагинальной флоры, в том числе бактериального вагиноза и степени его выражен- ности.
Следует отметить, что предлагаемый тест можно применять в качестве моноварианта диа- гностики или в комплексе с другими методами оценки состояния вагинального микробиоце-
THE DEVELOPMENT OF THE QUICK TEST TO ESTIMATE COLONIZATION RESISTANCE OF A VAGINAL BIOTOPE
Neschislyaev V.A.1, Stolbova M.G.1, Raev A.B.2
1Perm Branch «Biomed» of «Microgen» State Company, Perm;
2Medical unit № 9. of Tverye M.A., Perm.
Lactobacilli dominate in the normal vaginal microbiota, providing colonization resistance of the biotop due to their antagonistic activity in point of pathogenic and opportunistic microorganisms.
The decrease in the number of lactic acid bacteria causes the development of a vaginal biotope dys- biosis.
Considering that the traditional cultural method of diagnosis is laborious and long‑continued, it seems advisably to develop and implement a quick test to diagnose the dysbiosis of vagina connected with elimination of lactobacilli and reduction of biotope colonization resistance.
The developed method for colonization resistance estimation is based on the in vitro antagonistic activity quantification of isolated mixed vaginal culture, influencing on bioluminescence of culture genetically modified Escherichia coli with gene of luminescence for two‑hour joint exposure.
Luminometer series «Biotox» is measuring device for luminescence registration, which allows to calculate automatically the index of antagonistic activity, quantitatively equal to the percentage of luminescence reduction compared to the baseline was used. The low value of the index (<50%) indicates a decline of antagonistic activity and the number of lactobacilli in the vaginal flora, and consequently biotope colonization resistance. Based on the obtained results it is possible to draw a conclusion about presence or absence vaginal flora dysbiosis, including bacterial vaginosis and its degree of manifestation.
It should be noted that the proposed test can be used as an independent diagnostic procedure or in combination with other methods of the vaginal microbiota estimation.
ПОЛУЧЕНИЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИ цЕННЫХ АНАЛОГОВ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА АРЕНИцИНА МЕТОДОМ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА Пантелеев П.В., Болосов И.А., Морозова Х.А., Баландин С.В., Овчинникова Т.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
Возможность использования эндогенных антимикробных пептидов (АМП) для борьбы с ин- фекциями, вызываемыми антибиотикорезистентными патогенами, в последние годы привлекает пристальное внимание исследователей в связи со снижением терапевтической эффективности традиционных противоинфекционных средств. Большинство АМП характеризуются широким спектром антимикробной активности, способностью быстро уничтожать клетки‑мишени и мем- бранолитическим механизмом действия. К числу наиболее активных и устойчивых к действию протеаз АМП животного происхождения относятся молекулы, образующие стабилизирован- ную дисульфидными связями β‑шпилечную структуру. Однако сравнительно высокая цитоток- сичность данных пептидов является препятствием на пути к созданию лекарственных средств на их основе.
Представителями данного класса АМП являются ареницины – катионные пептиды, вы- деленные из целомоцитов морского кольчатого червя Arenicola marina [1]. Молекулы аре- ницинов состоят из 21 аминокислотного остатка и стабилизируются одной дисульфидной
связью, образующей 18‑членный макроцикл. С целью создания антимикробного средства, обладающего пониженной цитотоксичностью по сравнению с природным ареницином‑1, методами генной инженерии было получено семейство модифицированных аналогов это- го пептида, содержащих аминокислотные замены в ряде положений полипептидной цепи.
Методика получения аналогов ареницина‑1 была основана на сайт‑направленном мутагенезе плазмиды pET‑His8‑TrxL‑Ar1, которая использовалась ранее для гетерологической экспрес- сии пептида, идентичного природному. Особенностью данной системы экспрессии является использование РНК‑полимеразы и промотора бактериофага Т7 в клетках E.coli BL21(DE3).
В ходе экспрессии целевой пептид получали в виде гибридного белка, содержащего окта- гистидиновую последовательность и модифицированный тиоредоксин, обеспечивающие, со- ответственно, возможность аффинной очистки белка и нейтрализацию его токсичности для клетки‑продуцента. Введение необходимых замен осуществляли с помощью серии реакций инвертированной ПЦР‑амплификации экспрессирующей плазмиды с мутагенизирующими праймерами. В роли последних выступали смысловые олигонуклеотиды, предназначенные для отжига на участке плазмиды, кодирующем последовательность ареницина‑1, и содержа- щие точечные нуклеотидные замены. Обратным праймером служил универсальный праймер на С‑концевую область тиоредоксина. В 5’‑концевые участки праймеров были введены сайты рестрикции HindIII, что позволило проводить рециркуляризацию плазмиды с помощью лигаз- ной реакции по липким концам. Отбор аналогов ареницина с повышенным терапевтическим индексом проводили на основе сравнительного тестирования их антимикробной и гемолити- ческой активности.
Работа поддержана в рамках ФЦП «Научные и научно‑педагогические кадры инновацион- ной России» на 2009‑2013 годы (соглашение № 8043 от 20.07.2012 г.).
1. Ovchinnikova T.V., Aleshina G.M., Balandin S.V., Krasnosdembskaya A.D., Markelov M.L., Frolova E.I., Leonova Y.F., Tagaev A.A., Krasnodembsky E.G., Kokryakov V.N.Purification and pri- mary structure of two isoforms of arenicin, a novel antimicrobial peptide from marine polychaeta Arenicola marina. FEBS Lett., 2004, 577(1‑2), 209‑214.
PRODUCTION OF THERAPEUTICALLY VALUABLE ANALOGS OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE ARENICIN USING SITE-DIRECTED MUTAGENESIS
Panteleev P.V., Bolosov I.A., Morozova K.A., Balandin S.V., Ovchinnikova T.V.
Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences,
Miklukho-Maklaya str. 16/10, 117997 Moscow, Russia
In recent years, endogenous antimicrobial peptides (AMP) have received extensive attention as possible alternatives to conventional antibiotics due to their rapid efficacy to a broad range of multi- resistant pathogens, the membranolytic mode of action and the consequent low rate of resistance de- velopment. Among the most potent and proteolytically resistant AMPs of animal origin are molecules forming β‑hairpin structure stabilized by disulphide bonds. However their comparatively high toxicity against mammalian cells is an obstacle in the way of development of AMP‑based therapeutics.
Representatives of this class are arenicins – cationic peptides purified from coelomocytes of the marine polychaeta Arenicola marina [1]. Arenicins are 21‑residue antimicrobial peptides stabilized by a single disulfide bond, forming a large 18‑residue ring. To gain a better understanding of structure‑
activity relationships and to search for antimicrobials having lower cytotoxicity we designed a num-
The modified arenicin analogs were obtained by site‑directed mutagenesis of plasmid pET‑His8‑
TrxL‑Ar1 which had been used earlier for heterological expression of the original peptide. This ex- pression system is based on the use of bacteriophage T7 RNA polymerase and T7lac promoter in E.coli BL21(DE3) cells. To improve yield and to facilitate the purification process the recombinant peptides were obtained in the form of fusion proteins with N‑terminal octahistidine tag and modified thioredoxin A.
The mutagenesis technique was based on inverse PCR amplification of the whole expression plas- mid. A set of mutagenic oligonucleotides which annealed at the arenicin‑1 coding sequence were used as sense primers, and one universal oligonucleotide specific to C‑terminal part of modified thi- oredoxin A acted as antisense primer. The HindIII restriction sites were incorporated into 5’‑ends of primers to facilitate PCR product recirculation by ligation using compatible cohesive ends. The most therapeutically valuable analogs were selected by comparative analysis of their antimicrobial and hemolytic activities.
The work was supported by the Russian Federal Target Program “Scientific and Scienсe‑Educational Personnel of Innovative Russia for 2009 to 2013” (the state contract №8043).
1. Ovchinnikova T.V., Aleshina G.M., Balandin S.V., Krasnosdembskaya A.D., Markelov M.L., Frolova E.I., Leonova Y.F., Tagaev A.A., Krasnodembsky E.G., Kokryakov V.N.Purification and pri- mary structure of two isoforms of arenicin, a novel antimicrobial peptide from marine polychaeta Arenicola marina. FEBS Lett., 2004, 577(1‑2), 209‑214.
ИММОБИЛИЗАцИя ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КРАБА НА ПОЛИСАХАРИДНЫЕ НОСИТЕЛИ
Распопова Е.А., Коротаева А.И., Белов А.А.
РХТУ им. Д.И. Менделеева, каф. биотехнологии;
НИИ текстильных материалов E-mail: ABelov2004@ yandex.ru
Существует много способов введения лекарственных препаратов и биологически активных веществ в текстильный материал. Наиболее часто используемые, это химическая иммобилиза- ция, основанная на образовании различных химических связей между лечебным веществом и функциональными группами волокна, и иммобилизация лечебных препаратов за счет физиче- ских сил. Модификация (иммобилизация) фермента, способная избирательно ограничить его контакт с рецепторами клеток, представляется наиболее реальным путем снижения повреж- дающего действия данной группы препаратов. Цели и задачи иммобилизации ферментов, на- правленные на придание им свойств, необходимых для лекарственных средств, разнообразны.
Как показал опыт, решение проблемы реально, и если ряд вопросов не решен в полной мере, то несомненно доказана принципиальная возможность существенного смягчения отрицательных свойств нативных субстанций.
Основные проблемы, которые возникают при разработке и выпуске перевязочных материа- лов содержащих ферменты:
1‑ падение ферментативной активности в процессе иммобилизации препарата;
2‑ падение ферментативной активности в процессе высушивания иммобилизованного пре- парата;
3‑ падение ферментативной активности в процессе хранения иммобилизованного препара- та;4‑ падение ферментативной активности в процессе стерилизации иммобилизованного пре- парата;
5‑ падение ферментативной активности в процессе использования иммобилизованного препарата (действие температуры тела, рН, различных ингибиторов и т.д.).
В данной работе было исследовано изменение ферментативной активности (ФА) в процессе иммобилизации, высушивании и хранении протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба (ПК) на различные носители: хитозановые гели (Хт), целлюлозу (Ц), диальдегидцеллю- лозу (ДАЦ), Ц‑Хт и ДАЦ‑Хт. Наибольшие потери ФА вызывают Ц и ДАЦ. Это может быть свя- зано как с попаданием фермента в поры носителя, так и взаимодействием альдегидных групп модифицированного полимера с белковой глобулой. Высушивание ПК на полиэтиленовой подложке на воздухе, не ведет к значительному изменению ФА (потери ФА не более 10‑15%).
Кинетика инактивации иммобилизованных ферментов, в процессе хранения, описывается ха- рактерной для гидролаз сложной экспоненциальной (Aτ/Ao=a1*e-k1τ + a2*e-k2τ) зависимостью.
В полулогарифмических координатах установленные зависимости имеют вид ломаной линии, каждая из которых описывается уравнением первого порядка. Двухфазная кинетика инактива- ции иммобилизованных форм протеиназ – факт известный в литературе. Кинетические законо- мерности такого рода могут быть объяснены общим механизмом инактивации, включающим существование двух форм фермента, различающихся активностью и устойчивостью к денату- рирующим воздействиям. Т.е., вне зависимости от конкретных деталей механизма и соотно- шения элементарных констант, двухэкспоненциальный характер инактивации показывает, что механизм инактивации включает две различающиеся по активности или устойчивости формы фермента.
IMMOBILIZATION OF PROTEOLYTIC COMPLEX FROM HEPATOPANCREAS CRAB IN POLYSACCHARIDES CARRIERS
E.A.Raspopova, A.I.Korotaeva, A.A.Belov RCTU him. D.I.Mendeleeva, ch. Biotechnologies, Research Institute of Textile Materials.
E-mail: ABelov2004@ yandex.ru
There are many ways of introduction of medicinal preparations and biologically active substances in textile material. The most commonly used, is the chemical immobilization, based on the formation of various chemical bonds between the medical substance and functional groups of fiber, and immo- bilization of medicinal drugs at the expense of the physical forces. Modification (immobilization) of an enzyme that is capable of selectively limit its contact with the receptor cells, seems to be the most real way of reducing the damaging action of this group of drugs. Goals and objectives of the immo- bilization of enzymes, aimed at giving them the properties required for drugs, varied. As experience has shown, the solution of the problem is real, and if a number of issues not resolved to full extent, then undoubtedly proved the principal possibility of significantly reducing the negative properties of alternative substances.
The main problems that arise in the design and manufacture of bandaging materials containing enzymes:
1 ‑ the fall of enzymatic activity in the process of immobilization of the product;
2 ‑ the fall of enzymatic activity in the process of drying of immobilized product;
3 ‑ the fall of enzymatic activity in the process of storage immobilized product;
4 ‑ the fall of enzymatic activity in the sterilization process immobilized product;
5 ‑ the fall of enzymatic activity in the process of use of immobilized product (action body tem- perature, pH, various inhibitors, etc.).