критичний стан з наявністю нульових або від’ємних значень діастолічного компонента в артеріях пуповини.
Внутрішньоутробний стан плода під час вагітності оцінювали за допомогою біофізичного профілю плоду (БПП) за методикою F. A. Manning et аl. [74, 75]. Кардіотокографічне дослідження проводили на апараті “Fetal Monitor FC 700” (Bionet Co., LTD, Корея) непрямим методом. Визначали такі параметри як нестресовий тест, дихальні рухи, ворушіння, тонус плода, амніотичний індекс, які оцінювали від 0 до 2 балів. Сума в 7-10 балів відповідає задовільному стану плода, 5-6 балів – сумнівному, 4 бали та нижче – патологічному.
2.2.2. Методика проведення бактеріоскопічного та бактеріологічного досліджень
Дані дослідження виконувались на базі центральної клінічної лабораторії обласного перинатального центру м. Івано-Франківська.
Забір матеріалу для бактеріоскопічного дослідження проводили із стандартних точок (цервікальний канал, заднє склепіння піхви, осад першої порції сечі) з мікроскопією нативних мазків, діагностики патогенної флори (грамнегативні палички, коки, гриби, трихомонади та ін.). Досліджуваний матеріал наносять на предметне скло тонким і по можливості рівним шаром.
Дають препарату висохнути на повітрі та фіксують одним із загальноприйнятих методів, зокрема за Романовським-Гімзою [86]. Даючи оцінку мазку, визначається кількість епітеліальних клітин, лейкоцитів, характер мікрофлори (палички Додерлейна, патогенна флора - грамнегативні палички, коки, гриби, трихомонади, гонококи), а також реакцію вагінального вмісту.
Матеріал для бактеріологічного дослідження вмісту цервікального каналу та заднього склепіння піхви забирали за допомогою стерильного тампону. Визначали такі мікроорганізми, як: стафілокок епідермальний, золотистий, стрептокок фекальний, кишкова паличка, протей, клебсієла,
гриби роду кандида . Обстеження проводили за методикою секторального посіву на щільні середовища, що дозволяє визначити ступінь мікробного обсіменіння та виявити максимально можливий спектр аеробної та факультативно-анаеробної мікрофлори. Для виділення чистих культур використовували механічні та біологічні методи [86].
2.2.3. Методика дослідження полімеразно-ланцюговою реакцією.
Дані дослідження виконувались в умовах клініко-діагностичної лабораторії
“Пріма МЕД” медичного центру приватного підприємства “Пріма МЕД”.
Для визначення антигенів хламідій, уреаплазми, мікоплазми, вірусу генітального герпесу, цитомегаловірусу в цервікальному каналі використовували набори реагентів для полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР) до перечислених вище видів інфекцій (відповідно “АмплиСенс Chlamidia tr.- FL”, “АмплиСенс Ureaplasma spp.-FL”, “АмплиСенс Micoplasma gom.ген- FL”, “АмплиСенс HSV I, II-FL”, “АмплиСенс CMV-FL”).
Етапи проведення ПЛР діагностики є наступні:
- екстракція (виділення з досліджуваного матеріалу дезоксирибонуклїнової кислоти (ДНК));
- ампліфекація фрагмента ДНК даних мікроорганізмів (на аналізаторі
«Терцик»);
- гібридизаційно-флюоресцентна детекція, яка проводиться в ході ПЛР дослідження або після її завершення (на аналізаторі «AII-1»).
З отриманими пробами ДНК проводиться реакція ампліфікації фрагмента до відповідного фрагмента збудника за допомогою специфічних праймерів та фермента Taq-полімерази. У складі реакційної суміші присутні флуорисцентно-мічені олігонуклеотидні зонди, які гібридизуються з комплементарною ділянкою ампліфікуючої ДНК-мішені, в результаті відбувається зростання інтенсивності флуорисценції. Детекція флуорисцентного сигналу здійснюється за допомогою ПЛР-дитектора або
ампліфекатора з системою детекції флуорисцентного сигналу в режимі реального часу.
Інтерпритація результатів виконується автоматично за допомогою програмного забезпечення до набору. Результат оцінюється як: виявлено, не виявлено, невалідний (нижче порогового значення від’ємного результату), сумнівний (сигнал знаходиться між пороговими значеннями).
2.2.4.Методика проведення гормональних методів дослідження
Рівень гормонів вільного естріолу, плацентарного лактогену, прогестерону, кортизолу в сироватці крові визначали методом імуноферментного аналізу за допомогою наборів реагентів “Access Unconjugated Estriol” (Beckman Coulter, США), “hPL ELISA EIA-1283”
(“DRG”, Німеччина), “ПРОГЕСТЕРОН-ИФА” (“Хема-Медика”, Російська Федерація) та “Access Cortisol Calibratior S0” (Beckman Coulter, США) відповідно на імуноферментному аналізаторі «Тесаn» типу «Sunrise» в клініко-діагностичній лабораторії “Пріма МЕД” медичного центру приватного підприємства “Пріма МЕД”.
На внутрішній поверхні лунок планшета іммобілізовані мишачі (для прогестерону, плацентарного лактогену), кролячі (для вільного естріолу, кортизолу) моно та поліклональні антитіла до відповідних гормонів.
Досліджуваний гормон зі зразка конкурує з кон’югованим гормоном за зв’язування з антитілами на поверхні лунки. У результаті утворюється пов’язаний з пластиком “сендвіч”, що містить пероксидазу. Під час інкубації з розчином субстрату тетраметилбензидину відбувається фарбування розчинів в лунках. Інтенсивність забарвлення обернено пропорційна концентрації досліджуваного гормону в досліджуваному зразку.
Концетрацію гормонів у досліджуваних зразках визначають за калібрувальним графіком залежності від оптичної щільності в калібрувальних пробах.
Вивчення ендотеліну-1 та оксиду азоту в сироватці крові проводили на базі Діагностичного центру ТзОВ “ДІАМЕБ” шляхом імуноферментного аналізу на «STAT FAX – 300» аналізаторі, використовуючи набори реактивів
“Biomedica” (Австрія) та “RDS” (Англія).
Кількісне визначення ендотеліну-1 грунтується на визначенні його
“вільних” форм. У цьому методі мишині моноклональні антитіла, які вироблені проти ендотеліну-1 людини, використовуються для взяття на пробу. Принцип методу побудований на ферментному перетворенні нітрату (NO2) в нітрит (NO3) через нітрат-редуктазу. Нітрит, нестійка до розпаду сполука, яка абсорбує видиме світло при 540 нг й легко вимірюється фотометром.
Кількісне визначення оксиду азоту грунтується на ферментному перетворенні нітрата в нітрит через нітрат редуктазу. Після цього проводиться калориметричне визначення нітриту – кольороутворюючої речовини реакції Гріса. Реакція Гріса базується на двохкроковій реакції діазотизації, при якій окислений NO 2-виробляє нітрозуючу речовину, яка реагує з сульфаніловою кислотою і виробляє іони діозонія. Ці іони потім зв’язуються з N-(1-naphthyl) ethylenediamine для формування хромофорноазотної похідної, яка адсорбує світло при 540-570 нм.
Всі вищевказані біологічні речовини визначали до лікування (27-29 тижні) та після лікування (32-33 тижні).
2.2.5. Методика проведення кардіоінтервалографії.
Вивчення стану ВНС проводили на кафедрі радіології та радіаційної медицини ДВНЗ “Івано-Франківський національний медичний університет”
(завідувач кафедрою – д. мед. наук, професор Рижик В.М.).
Дослідження проводили на апараті «КардіоЛаб» (Харків), за методикою Р.М. Баєвського та співавт., 1984р., яким реєстрували моніторний ЕКГ-запис протягом 10 хвилин. Електроди основних відведень накладають за
загальноприйнятою методикою. Для достовірного вивчення параметрів варіабельності ритму серця (ВРС) вибирають ЕКГ-відведення з максимальною амплітудою R-піка та мінімальною кількістю артефактів, що забезпечить високу точність вимірювання R- R інтервалів.
Нами в терміні гестації 27-29 тижні та 32-33 тижні при застосуванні фонової та ортостатичної проб проводився аналіз наступних показників варіабельності серцевого риту: частота серцевих скорочень (ЧСС, уд/хв), NN, Мода (Мо, сек) – найбільш поширене значення R-R, що вказує на домінуючий рівень функціонування синусного вузлу, Амплітуда моди (АМо, %) – частка кардіоінтервалів у відсотках, яка відповідає значенню моди і відображає ступінь активації симпатичного відділу ВНС, варіаційний розмах (ВР, сек) – різниця максимальним та мінімальним значенням R-R кардіоритмограми, індекс напруження регуляторних систем (ІН) або стрес індекс – відображає ступінь централізації управління серцевим ритмом та характеризує активність симпатичного відділу ВНС, індекс вегетативної рівноваги (ІВР) – відображує співвідношення симпатичної та парасимпатичнох регуляції серцевої діяльності.
Також вивчали наступні спектральні показники: потужність спектру дуже низькочастотного компоненту варіабельності (Very Low Frequency, (VLF), абсолютне значення, мс2) – відображає активацію центральних енерготропних систем регуляції вегетативного тонусу; потужність спектру низькочастотного компоненту варіабельності (Low Frequency (LF), абсолютне значення, мс2) – відображає активність вазомоторного центру, потужність спектру високочастотного компоненту варіабельності (High Frequency (HF), абсолютне значення, мс2) – відображає активність парасимпатичної ланки регуляції та їх відносну потужність складової спектру у відсотках (%), а також LF/HF – симпатико-вагальний індекс, який характеризує співвідношення чи баланс симпатичних або парасимпатичних впливів на ритм серця.
2.2.6. Оцінка психоемоційного стану.
Психоемоційний стан жінок оцінювали шляхом опитування за допомогою шкали, запропонованої С.Д. Спілбергером та адаптованої Ю.А. Ханіним (1978), що складається з двох підшкал: особистісної та ситуативної (реактивної) тривожності. Пропонується 40 запитань на які необхідно одразу відповідати, не затрачаючи час. Після проведення тесту підраховується сума балів по шкалам та для інтерпритації результатів використовується ключ.
2.2.7. Морфологічне дослідження посліду
Дослідження виконувалось на базі лабораторії кафедри патоморфології та судової медицини ДВНЗ “Івано-Франківського національного медичного університету” (завідувач кафедрою – д. мед. н., професор Михайлюк І.О.).
Дослідження плацент проводилось за схемою, яка включала в себе макроскопічний аналіз, забір матеріалу та подальше гістологічне дослідження.
У всіх досліджуваних групах проводили визначення основних органометричних параметрів плаценти, пуповини та вільних плодових оболонок, оцінки варіанту прикріплення пуповини до плаценти. Вивчали стан навколоплідного простору, ворсинкового дерева та пуповини.
Морфологічне дослідження посліду виконувалось на органному, тканинному та клітинному рівнях. Вивчення органного рівня організації посліду передбачало визначення основних органометричних параметрів плаценти, пуповини та вільних плодових оболонок, оцінки варіанта прикріплення пуповини до плаценти, типу розгалуження судин хоріальної пластинки, описової характеристики материнської поверхні народженої плаценти з оцінкою особливостей будови котиледонів. Визначалася маса кожної плаценти без оболонок з культьою пуповини не більше 1 см. Далі з
фіксованої плаценти через всю товщину органу вирізали 6-8 шматочків з параумбілікальної, центральної та крайової зон, 3-5 шматочків плідних оболонок та 1-2 шматочки пуповини на висоті 8-10 см від плаценти.
Отриманий матеріал фіксували 48 годин у 10% розчині нейтрального формаліну, зневоднювали в серії спиртів наростаючої концентрації, заливали в парафін і готували серійні зрізи товщиною 5-6 мкм. з наступним забарвленням гематоксиліном і еозином.
Оцінка диференціювання структур ворсинкового дерева за ступенем його зрілості проводилось з використанням класифікації, запропонованої І.С. Давиденком [30, 43].
Отримані мікропрепарати аналізували на мікроскопі Carl ZEISS Axiostar plus (Microlmaning, Німеччина), обладнаному фотокамерою Canon G 10 для отримання цифрових зображень.
2.2.8. Статистичні методи.
Для статистичного аналізу отриманих даних використовували програму Statistica 6.0. На підставі кількісних даних вираховували середню арифметичну величину, середнє стандартне відхилення. На основі комп’ютерних програм в Microsoft Excel для категорійних (або якісних) даних проводили розрахунок відносних величин, їх похибок, t-тесту.
Достовірність отриманих показників підтверджувалась шляхом розрахунку похибки для відносних величин за загальновідомою формулою.
Для порівняння двох незалежних груп за однією ознакою застосовували непараметричний критерій Манна-Уїтні, для порівняння двох залежних груп – критерій Вілкоксона. Також вираховували критерій Хі- квадрат (χ2) та відношення шансів (Odds Ratio,OR). Різницю між величинами, які порівнювали, вважали достовірною при р<0,05.
РОЗДІЛ 3
ПЕРЕБІГ ВАГІТНОСТІ, ПОЛОГІВ, ПІСЛЯПОЛОГОВОГО ПЕРІОДУ ТА СТАН ФЕТОПЛАЦЕНТАРНОГО КОМПЛЕКСУ І ВЕГЕТАТИВНОЇ
НЕРВОВОЇ СИСТЕМИ У ЖІНОК З МАЛОВОДДЯМ