Parte I: Ação farmacológica dos andrógenos na bexiga urinária e uretra de animais em condição fisiológica (controle)

5.1.1. Resposta contrátil de bexigas isoladas

Em bexigas isoladas, foram feitas curvas concentração-resposta ao carbacol (CCh) e curvas frequência-resposta (1 – 32 Hz) em tecidos pré-incubados com veículo (álcool, 1 µL), testosterona (100 nM) e 5α-DHT (100 nM) durante 30 minutos.

A adição cumulativa de carbacol induziu contrações na bexiga do tipo concentração- dependente, sendo que a pré-incubação com testosterona reduziu significativamente a contração máxima (Emax) comparado com grupo veículo (P < 0,05; Figura 8A). A incubação com 5α-DHT

também reduziu marcantemente a Emax ao carbacol comparado com o grupo veículo (Figura

8C). Em relação aos valores de potência (pD2) do carbacol não encontramos diferenças

significativas para testosterona ou 5α-DHT em relação ao grupo veículo (Testosterona: 6,10 ± 0,04 vs. 6,21 ± 0,07, para veículo e testosterona, respectivamente; 5α-DHT: 6,17 ± 0,13 vs. 6,12 ± 0,10, para veículo e 5α-DHT, respectivamente).

A estimulação elétrica de campo promoveu contrações dependentes das frequências testadas. A pré-incubação com testosterona reduziu de modo significativo as contrações, principalmente nas frequências 2 a 32 Hz (Figura 8B). Da mesma forma, a pré-incubação de 5α-DHT produziu redução nas contrações neurogênicas, mostrando diferença significativa nas frequências 8 a 32 Hz (Figura 8D).

Figura 8. Respostas contráteis da bexiga de ratas controle ao carbacol (CCh) e estimulação elétrica (frequência) na presença de testosterona ou 5α-dihidrotestosterona (30 min). Curvas concentração- resposta ao carbacol (painéis A e C) e curva frequência-resposta à estimulação elétrica (EFS) (painéis B e D), na presença de veículo (álcool: 1 µL), testosterona (100 nM) e 5α-DHT (100 nM). Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (n= 4-6 animais/grupo). *P < 0,05 comparado com veículo.

Em seguida, decidimos incubar as preparações de bexiga com testosterona (100 nM) por 1 hora, a fim de investigar se os efeitos do hormônio são dependentes do tempo de exposição. Adicionalmente, pré-incubamos as preparações com flutamida (1 µM), fármaco que antagoniza seletivamente o AR, que poderia nos sugerir um mecanismo genômico através da ativação deste receptor.

Nossos dados mostraram que a testosterona continuou reduzindo significativamente a resposta máxima ao carbacol comparado com o grupo veículo (P < 0,05). A pré-incubação de

flutamida (1 µM, 1 h) não modificou de modo significante a resposta contrátil da bexiga ao carbacol e nem reverteu os efeitos inibitórios da testosterona sobre a contração da bexiga (Figura 9A). Os valores de potência para o carbacol não foram diferentes entre os diferentes grupos (6,27 ± 0,10, 6,11 ± 0,10, 6,23 ± 0,10 e 6,19 ± 0,04 para Veículo, Testosterona, Flutamida e Testosterona + Flutamida, respectivamente).

Na resposta contrátil induzida por EFS, foi observado efeito similar do carbacol; ou seja, testosterona reduziu as contrações, particularmente nas frequências 4, 16 e 32 Hz (P < 0,05), sendo este efeito não afetado pela pré-incubação de flutamida (Figura 9B). A flutamida individualmente também não modificou a resposta contrátil do grupo Veículo.

Figura 9. Efeito da flutamida (1 µM, 1 h) e testosterona (100 nM, 1 h) nas respostas contráteis ao carbacol (A) e estimulação elétrica (B) em bexigas isoladas de ratas controle. As respostas contráteis foram avaliadas na presença de veículo (álcool: 1 µL), testosterona (100 nM), flutamida (1 µM) ou simultaneamente testosterona + flutamida. Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (n= 4-6 animais/grupo). *_{P < 0,05 Veículo vs. Testosterona.} $_{P < 0,05 Veículo vs. Testosterona +} Flutamida. #_{P < 0,05 Flutamida vs. Testosterona + Flutamida.}

Em outro conjunto de experimentos, incubamos as preparações de bexiga com testosterona 3-(O-carboximetil)oxima:BSA (T-BSA: 100 nM) durante 1 hora. O hormônio, quando conjugado com a molécula de albumina sérica bovina (BSA), em virtude de seu elevado peso molecular, impede o andrógeno de atravessar a membrana plasmática e de ativar o AR nuclear. Por outro lado, o complexo formado em teoria passaria a ativar eventuais AR

localizados na membrana plasmática, o que nos permitiria caracterizar uma sinalização não genômica na parede vesical.

Nossos dados mostraram que T-BSA não modifica de modo significativo a resposta contrátil do carbacol nem em termos de Emax (Figura 10A) nem em termos de potência (5,93 ±

0,15 vs. 5,74 ± 0,10 para veículo e T-BSA, respectivamente). Da mesma forma, a pré-incubação do T-BSA não afetou a contração neurogênica evocada pela estimulação elétrica em nenhuma frequência (Figura 10B).

Figura 10. Efeito da testosterona 3-(O-carboximetil)oxima: BSA (T-BSA: 100 nM, 1 h) nas respostas contráteis ao carbacol (A) e estimulação elétrica (B) em bexigas isoladas de ratas controle. As respostas contráteis foram avaliadas na presença de veículo (álcool: 1 µL) e T-BSA (100 nM). Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (n = 5 animais/grupo).

5.1.2. Efeito da testosterona na resposta contrátil da bexiga induzida pelo CaCl2

Em bexigas isoladas de ratas controle, realizamos curvas concentração-resposta ao CaCl2 na presença de testosterona (100 nM) e/ou veículo (álcool, 1 µL), incubados por 30

minutos, em meio totalmente desprovido de cálcio. A adição cumulativa de CaCl2 causou

contrações dependentes da concentração em ambos os grupos estudados. Mas a incubação prévia de testosterona não modificou nem os valores de Emax (Figura 11) nem os de potência

Figura 11. Efeito da testosterona (30 min) na resposta contrátil da bexiga isolada de ratas controle ao cloreto de cálcio (CaCl2). Curva concentração-resposta ao CaCl2 na presença de testosterona (T: 100

nM, 30 min) ou veículo (álcool: 1 µL, 30 min). Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (n = 5 animais/grupo).

5.1.3. Resposta relaxante das bexigas isoladas

Em bexigas isoladas, foram construídas curvas concentração-resposta à própria testosterona (Figura 12A), mirabegron (Figura 12B) e ao isoproterenol (Figura 12C) em tecidos pré-contraídos com carbacol (1 µM).

Os valores de pré-contração dos tecidos não mostraram diferenças significativas entre os grupos veículo e testosterona (0.90 ± 0.14 vs. 1.01 ± 0.08 mN/mg, respectivamente). A testosterona individualmente não promoveu relaxamento significativo do tecido em relação ao grupo veículo.

Para o relaxamento induzido pelo mirabegron, utilizamos a testosterona e 5α-DHT. Os valores de pré-contração não foram significativamente diferentes entre os grupos veículo, testosterona e 5α-DHT (0.90 ± 0.08, 0.83 ± 0.15 e 1.03 ± 0.10 mN/mg, respectivamente). O mirabegron produziu relaxamento dependente da concentração com respostas similares entre os três grupos para os parâmetros de Emax (104%, 100% e 109%; Figura 12B) e potência (5,76

± 0,18, 5,25 ± 0,24 e 5,20 ± 0,63 para veículo, testosterona e 5α-DHT, respectivamente). O isoproterenol também produziu relaxamento concentração-dependente com respostas similares entre os grupos veículo e testosterona nos valores de Emax (90% vs. 93%) e potência (6,79 ± ,13

e 7,05 ± 0,11, para veículo e testosterona, respectivamente).

Figura 12. Respostas relaxantes da bexiga à testosterona individualmente, mirabegron e ao isoproterenol. A) Curvas concentração-resposta somente à testosterona (100 nM – 1 mM). B) Curvas concentração-resposta ao mirabegron na presença de veículo (álcool: 1 µL, 1 h), testosterona (100 nM, 1 h) e/ou 5α-DHT (100 nM, 1 h) e C) curvas concentração-resposta ao isoproterenol (ISO) na presença de veículo e testosterona. Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (n = 4-5 animais/grupo).

5.1.4. Respostas contráteis em uretra isoladas

Em uretras isoladas foram realizadas curvas concentração-resposta à fenilefrina na presença de testosterona (100 nM) e/ou 5α-DHT (100 nM). A fenilefrina induziu contrações concentração-dependente (Figura 13A, B). A pré-incubação dos tecidos seja com testosterona (100 nM, 30 min) ou 5α-DHT (100 nM, 30min), provocou aumento significativo na contração máxima quando comparado com o veículo (P < 0,05; Figura 13A, B). Os valores de potência à fenilefrina não diferiram entre os grupos experimentais tanto para testosterona como para 5α- DHT (Testosterona: 4,63 ± 0,23 vs. 4,94 ± 0,08 para veículo e testosterona, respectivamente; 5α-DHT: 4,97 ± 0,22 vs. 5.51 ± 0,18 para veículo e 5α-DHT, respectivamente).

Figura 13. Efeito da testosterona e 5α-dihidrotestosterona (5α-DHT) na resposta contrátil à fenilefrina em uretras isoladas de ratas controle. Curvas concentração-resposta à fenilefrina na presença de veículo (álcool: 0,5 µL), testosterona (A; T: 100 nM) e/ou (B; 5α-DHT: 100 nM) incubados durante 30 min. Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (n = 4-5 animais/grupo). * P < 0,05 comparado com o veículo.

Em seguida, na uretra, incubamos as preparações com testosterona durante 1 hora. À semelhança do tempo de incubação de 30 minutos, a testosterona aumentou de modo significativo (P < 0,05) a resposta contrátil à fenilefrina. Na sequência, realizamos incubação simultânea com testosterona e flutamida por 1 hora. A flutamida (1 µM) per se não modificou a Emax à fenilefrina, entretanto, junto com testosterona, a flutamida não reverteu os efeitos do

grupos (5,24 ± 0,17, 5,42 ± 0,15, 5,04 ± 0,10 e 5,19 ± 0,10 para veículo, testosterona, flutamida e testosterona + flutamida, respectivamente).

Figura 14. Efeito da testosterona e flutamida (1 µM) na resposta contrátil da uretra à fenilefrina. Curvas concentração-resposta à fenilefrina na presença de veículo (0,5 µL, 1 h), testosterona (100 nM, 1h) e/ou flutamida (10 µM, 1 h). Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (n = 5-6 animais/grupo). * P < 0,05 comparado com veículo. #_{P < 0,05 comparado com grupo testosterona.}

Posteriormente, incubamos nas preparações de uretra com o T-BSA (100 nM) durante uma hora. A pré-incubação de T-BSA mostrou efeito oposto ao observado pela testosterona e/ou 5α-DHT. Ou seja, T-BSA reduziu significativamente a resposta máxima à fenilefrina comparado com o grupo veículo (P < 0,05, Figura 15). Não houve diferença significativa na potência à fenilefrina entre os grupos veículo e T-BSA (5.30 ± 0.10 vs. 5.40 ± 0.12, respectivamente).

Figura 15. Efeito da testosterona 3-(O-carboximetil)oxima:BSA (T-BSA: 100 nM, 1 h) nas respostas contráteis à fenilefrina em uretras isoladas de ratas controle. As respostas contráteis foram avaliadas na presença de veículo (álcool: 1 µL) e T-BSA (100 nM). Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (n = 5 animais/grupo).

5.1.5. Efeito da testosterona na resposta contrátil induzida pelo CaCl2 em uretras isoladas

Em uretras isoladas de ratas controle realizamos curvas concentração-resposta ao CaCl2

na presença de testosterona e/ou veículo, incubados por 30 minutos. A figura 16A mostra que a adição cumulativa de CaCl2 provocou contrações do tipo concentração-dependente, mas esta

não foi afetada pela incubação prévia com testosterona. O hormônio também não modificou os valores de potência do CaCl2 (2,26 ± 0,12 vs. 2,42 ± 0,15 para veículo e testosterona,

respectivamente).

Em experimentos separados e como forma de validar nosso resultado anterior, avaliamos a resposta contrátil do CaCl2 na presença de nifedipina. Nosso resultado mostra que

a pré-incubação de nifedipina, na concentração 3 nM, não modificou a Emax, porém, com 30 nM

e 300 nM deste bloqueador notamos uma marcante redução da resposta contrátil, tendo uma diferença significativa na maior concentração (P < 0,05), evidenciando uma redução dependente da concentração (Figura 16B).

Figura 16. Efeito da testosterona na resposta contrátil induzida pelo cloreto de cálcio (CaCl2) em

uretra de ratas controle. A) Curvas concentração-resposta do CaCl2 na presença de testosterona (T: 100 nM, 30 min) ou veículo (álcool: 0,5 µL, 30 min), B) Curvas concentração-resposta do CaCl2 na presença de nifedipina em diferentes concentrações (3, 30 e 300 nM). Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (n = 4-5 animais/grupo). * P < 0,05 comparado com veículo.

5.1.6. Resposta relaxante das uretras isoladas

Em uretras isoladas construímos curvas concentração-resposta à testosterona e SNP em tecidos pré-contraídos com KCl (40 mM). O nível de pré-contração pelo KCl não foi diferente entre os grupos veículo e testosterona (0,97 ± 0,27 vs. 1,25 ± 0,18 mN/mg, respectivamente). A testosterona individualmente não promoveu relaxamento significativo em relação ao grupo veículo (Figura 17A).

Para se estudar os efeitos da testosterona sobre os efeitos relaxantes do SNP na uretra, inicialmente foi pré-incubado os tecidos com testosterona (100 nM) durante uma hora, antes de realizar curvas concentração-resposta com SNP. O nível de pré-contração pelo KCl não foi diferente entre os grupos veículo e testosterona (0,93 ± 0,21 vs. 0,91 ± 0.19 mN/mg, respectivamente). O SNP produziu relaxamento no tecido uretral de maneira concentração- dependente. Podemos observar que a incubação prévia da testosterona não afetou os parâmetros de Emax (Figura 17B) e potência, permanecendo similares entre os grupos (5,04 ± 0,23 vs. 5,30

Figura 17. Respostas relaxantes da uretra à testosterona individualmente e ao nitroprussiato de sódio (SNP) de ratas controle. A) Curvas concentração-resposta somente à testosterona (100 nM – 300 mM). B) Curvas concentração-resposta ao SNP na presença de veículo (álcool: 1 µL, 1 h) e testosterona (100 nM, 1 h). Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (n = 5-6 animais/grupo).

5.2. Parte II: Ação farmacológica dos andrógenos na bexiga urinária e uretra de ratas