FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
SANDRA MILENA BONILLA BECERRA
MECANISMO DE AÇÃO GENÔMICO E NÃO-GENÔMICO DOS ANDRÓGENOS NA MUSCULATURA LISA DO TRATO URINÁRIO INFERIOR DE RATAS SAUDÁVEIS E
OVARIECTOMIZADAS
CAMPINAS 2020
SANDRA MILENA BONILLA BECERRA
MECANISMO DE AÇÃO GENÔMICO E NÃO-GENÔMICO DOS ANDRÓGENOS NA MUSCULATURA LISA DO TRATO URINÁRIO INFERIOR DE RATAS SAUDÁVEIS E
OVARIECTOMIZADAS
ORIENTADOR: PROF. DR. EDSON ANTUNES
CAMPINAS 2020
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Farmacologia.
ESTE TRABALHO CORRESPONDE Á VERSÃO FINAL DA TESE DE DOUTORADO DEFENDIDA PELA ALUNA SANDRA MILENA BONILLA BECERRA, E ORIENTADA PELO PROF. DR. EDSON ANTUNES.
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Bonilla Becerra, Sandra Milena,
B641m BonMecanismo de ação genômico e não-genômico dos andrógenos na musculatura lisa do trato urinário inferior de ratas saudáveis e
ovariectomizadas / Sandra Milena Bonilla Becerra. – Campinas, SP : [s.n.], 2020.
BonOrientador: Edson Antunes.
BonTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
Bon1. Testosterona. 2. Di-hidrotestosterona. 3. 5-alfa-redutase da testosterona. 4. Receptores androgênicos. 5. Canais de cálcio tipo L. 6. Bexiga. 7. Uretra. I. Antunes, Edson, 1960-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Genomic and non-genomic mechanisms of androgens in the lower urinary tract smooth muscle of healthy and ovariectomized rats
Palavras-chave em inglês: Testosterone
Dihydrotestosterone
Testosterone 5-alpha-reductase Androgenic receptors
Calcium channels, L-Type Bladder
Urethra
Área de concentração: Farmacologia Titulação: Doutora em Farmacologia Banca examinadora:
Edson Antunes [Orientador] Cristina Antoniali Silva Mário Ângelo Claudino Luiz Gustavo Oliveira Brito Bruno Rodrigues
Data de defesa: 30-10-2020
Programa de Pós-Graduação: Farmacologia Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0001-7715-5148 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/0963092880662126
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mudar o mundo ao nosso redor.
DEDICATÓRIA
Dedico este momento a los tres pilares de mi vida: A mis padres, Nayda e Leonardo y, a mi esposo Jhonattan.
Nayda y Leonardo, agradezco infinitamente por la fortuna de tenerlos como padres, por el amor que me profesan todos los dias, por todas las enseñanzas impartidas desde el momento que vine a este mundo, por los consejos, regaños, críticas constructivas y apoyo incondicional en todas las decisiones que me permitieron llegar hasta aquí. Todo lo que soy en grande parte se lo debo a Ustedes. Estoy agradecida con Dios y la vida que nos dio una segunda oportunidad para vivir juntos este grandioso momento. Gracias por ser ejemplo de vida, amor, respeto, esfuerzo y dedicación.
Jhonattan, gracias por ser mi compañero de vida, mi mejor amigo, mi consejero, mi apoyo en los momentos más difíciles, por prestarme tu hombro en momento de lágrimas y tenderme la mano cuando me viste caer. Gracias por tu amor, por creer siempre en mi, por tu paciencia, esfuerzo, dedicación y apoyo incondicional, porque sin ti a mi lado, el camino hubiera sido mucho más complicado. Te amo…
A Milo, mi cachorro, por ser mi compañía, soporte y motivo de felicidad durante todos estos años.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela oportunidade de viver, pela saúde, força, autocompaixão e resiliência que me concedeu ao longo desta caminhada.
Ao Professor Francisco Luis Cano, meu orientador na faculdade, meu muito obrigada pelo incentivo, motivação, perguntas inteligentes, discussões e ensinamentos que acrescentaram muito na minha vida pessoal e profissional. Sou muito grata pela confiança, por ter acreditado em mim e por ter me dado a oportunidade de começar a minha carreira científica/acadêmica.
Ao Professor Edson Antunes, a minha eterna gratidão por ter me recebido e acolhido, contribuindo para que a minha estância no Brasil fosse mais leve. Meu muita obrigada por todos os conselhos, ensinamentos, reuniões e discussões que ajudaram a me tornar uma melhor pessoa e profissional e, o mais importante, pela oportunidade de aprender ciência ao seu lado. Você é um exemplo de ser humano e profissional.
Aos meus familiares, amigos e amigas de Colômbia, com carinho especial para meu Tio-Avô Oswaldo, a minha madrinha Yasmila, as minhas amigas Yenifer, Sady, Virney e Karen, agradeço pelo apoio, forças e companhia durante todos esses anos apesar da distância geográfica.
À Família Moda, com carinho especial para Cida, Toninho e Silvia, agradeço por ter me recebido, acolhido e cuidado ao longo dos anos que estive ao lado de vocês. Sou muito grata por ter vocês por perto.
As minhas amigas e amigos do Departamento de Farmacologia Camila, Rita, Alberto, Mariana Taranto, Mariana Morau, Gabriela Passos, Gabriela Bertollotto, Edith, Karol, Fabiano, Eduardo, Glaucia, Dailson, Junia, Vanessa, Julia, Carol Guezzi, Felipe, Carol Lescano, Natalicia, Luiz Kiguti, David, Rafael, Matheus, Ákila e aos meus colegas de laboratório, agradeço pelo apoio, amizade, risadas e todos os momentos inesquecíveis dentro e fora do Departamento. Aos meus amigos da cascata, especialmente Mari Taranto, Fabiano, Eduardo, Luiz Kiguti e Julio, meu muita obrigada por todos os ensinamentos e parceira a partir do momento que cheguei ao laboratório. Tudo o que fizeram por mim me ajudou a me tornar a pesquisadora que sou hoje.
Aos Professores do Departamento de Farmacologia Fabíola Mónica, Elen Landucci, Stephen Hyslop, Gabriel Forato Anhê, Sisi Marcondes e Patricia Moriel, muita obrigada pela amizade, as aulas ministradas, todo o conhecimento compartilhado e pela convivência diária durante todos os meus anos no Departamento.
Aos funcionários do Departamento de Farmacologia Ivanni, Agnaldo e, com carinho especial, Miguel Borges, agradeço não só pelo cuidado dos animais de experimentação, como também pelas conversas e risadas que alegraram os meus dias no Departamento. A Cidinha e, especialmente a Gustavo Teramatsu, agradeço a amizade, disposição e ajuda incondicional.
O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001, do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq), bolsa processo no
146942/2016-7 e da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) processo no 2017/26564-9.
RESUMO
O declínio hormonal na mulher leva à chamada síndrome geniturinária na menopausa (SGM), que compreende, entre outros fatores, sintomas do trato urinário inferior (STUI) como aumento da frequência miccional, urgência, noctúria e incontinência urinária, os quais impactam negativamente a qualidade de vida e interação social da pessoa. A terapia de reposição hormonal com testosterona vem sendo utilizada em mulheres pós-menopausadas para aliviar certos sintomas da deficiência androgênica como perda da libido, da massa osteomuscular e da função cognitiva. Entretanto, poucos estudos têm se voltado à compreensão dos efeitos desta reposição androgênica na disfunção miccional na pós-menopausa. Estudo prévio do nosso grupo avaliou os efeitos da reposição com testosterona na disfunção miccional de ratas, após 4 meses de ovariectomia (OVX). A redução hormonal causou alterações miccionais in vivo (aumento da frequência e das pressões basal, limiar e pós-miccional), assim como hipocontratilidade vesical e hipercontratilidade uretral in vitro, as quais foram revertidas pelo andrógeno em dose suprafisiológica. Estes efeitos protetores da testosterona mostraram-se independentes da síntese de estrógeno, pois mantiveram-se presentes mesmo após tratamento dos animais com letrozol (inibidor da aromatização da testosterona). Porém, ainda não conhecemos o mecanismo de ação dos andrógenos na musculatura lisa do trato urinário inferior (bexiga e uretra) em condições fisiológicas e patológicas (OVX), não se sabendo, inclusive, se é resultado de mecanismo genômico, não-genômico ou ambos. Nossos resultados mostraram que a pré-incubação in vitro com os andrógenos (testosterona e/ou 5α-dihidrotestosterona) provocam respostas diferentes dependendo da condição experimental e do tecido. Em bexigas de ratas controle, os andrógenos (100 nM) reduziram significativamente as respostas contráteis ao carbacol e estímulo elétrico (P < 0,05), sem modificar aquela do cloreto de cálcio (CaCl2).
Nas uretras dos animais controle, a testosterona aumentou a resposta contrátil à fenilefrina (P < 0,05), sem modificar a contração induzida pelo CaCl2. As respostas relaxantes da bexiga
induzidas por isoproterenol, mirabegron e, nitroprussiato de sódio (SNP) na uretra não foram modificadas de modo significativo pela testosterona. Nestes animais controle, a pré-incubação dos tecidos com flutamida (bloqueador do receptor nuclear de andrógeno) não modificou os efeitos vesicais e uretrais dos andrógenos. Diferentemente da condição fisiológica, em ratas ovariectomizadas, os andrógenos reverteram tanto a hipocontratilidade vesical ao carbacol como a hipercontratilidade uretral à fenilefrina e ao CaCl2 (P < 0,05). Além disso, nas ratas
Enquanto à maquinaria relaxante na uretra, notamos que a OVX potencializou, ao nível de pEC50, o efeito relaxante do SNP. Finalmente, dados de RT-PCR em bexiga mostraram que a
OVX não modifica a expressão de receptores M2 e M3, L-VOCC, AR e 5a-redutase, mas
reduziu significativamente a expressão do receptor β3-adrenérgico. Em uretra, OVX aumentou
a expressão do AR, da 5α-redutase, L-VOCC e nNOS. O receptor β2-adrenérgico, GPRC6A e
aromatase (bexiga), assim como receptores α1a, α1b, 1d, GPRC6A e aromatase (uretra), não
foram passíveis de detecção. No conjunto, nossos dados parecem indicar que na condição fisiológica os andrógenos favorecem o enchimento vesical por relaxar a bexiga e contrair a uretra, através de mecanismos não-genômicos. Na OVX, os andrógenos são capazes de normalizar o quadro de bexiga hipoativa, promovendo esvaziamento vesical, que se faz por aumento da contração da bexiga e redução da contração uretral, ambos dependentes da ativação de mecanismos genômicos clássicos. Dessa forma, compreendendo o mecanismo de ação dos andrógenos no trato urinário inferior nos permitirá sugerir a reposição com andrógenos como alternativa terapêutica para as complicações urológicas na pós-menopausa.
Palavras chaves: Testosterona, 5α-dihidrotestosterona, 5α-redutase, ovariectomia, canais de
ABSTRACT
The hormonal decline in women leads to the so-called genitourinary syndrome on menopause (GSM), that include, among other factors, the lower urinary tract symptoms (LUTS) such us increment of urinary frequency, urgency, noctúria and urinary incontinence, affecting negatively the quality of life and social interaction of the person. The hormonal replacement with testosterone has been used in postmenopausal women to relieve certain symptoms of the androgenic deficiency as loss of libido, loss of musculoskeletal mass and cognitive function. However, few studies have focused to understanding of effects of androgenic replacement on voiding dysfunction. A previous study of our group evaluated the effects of testosterone replacement on voiding dysfunction in rats after 4 months of ovariectomy (OVX). Hormonal reduction causes in vivo voiding changes (increment of frequency and the basal, threshold and post-voiding pressures), as well as bladder hypocontractility and urethral hypercontractility in
vitro which were reverted by androgen in supraphysiological doses. These protective effects of
testosterone were independent of estrogen synthesis, because they remained even after treatment with letrozol (inhibitor of aromatization of testosterone). However, we still do not know the mechanism of action of androgens on the smooth muscle of lower urinary tract (bladder and urethra) under physiological and pathological condition (OVX), and it is not known whether it is the result of a genomic, non-genomic mechanisms or both. Our results showed that in vitro pre-incubation with androgens (testosterone and/or 5α-dihydrotestosterone) elicit different responses depending of the tissues and experimental conditions. In bladder of intact rats, the androgens (100 nM) significantly reduced the contractile responses to carbacol and electrical stimulus (P < 0.05), without modifying the response of calcium chloride (CaCl2). In urethra of intact rats, the testosterone increased the
contractile response to phenylephrine (P < 0.05), without changes the contraction induced by CaCl2. The relaxing responses of bladder to isoproterenol, mirabegron and sodium nitroprusside
(SNP) in the urethra were not significantly modified by testosterone. In these intact rats, the pre-incubation of the tissues with flutamide (antagonist of nuclear androgen receptor) did not modified the bladder and urethral effects of androgens. Unlike of physiological condition, in ovariectomized rats, the androgens reverted bladder hypocontractility to carbacol, as well as, urethral hypercontractility to phenylephrine and CaCl2 (P < 0.05). In addition, in
ovariectomized rats, flutamide totally prevented the bladder and urethral effects of androgens. About the relaxing machinery in the urethra, we note that OVX enhanced, in the pEC50, the
relaxing effect of SNP. Finally, RT-PCR data in bladder showed that OVX does not modify the expression of M2 and M3 receptor, L-VOCC, AR and 5α-reductase, but reduced significantly
the expression of β3-adrenergic receptor. In urethra, OVX increased the AR, 5α-reductase,
L-VOCC and nNOS expression. The β2-adrenergic receptor, GPRC6A and aromatase (bladder),
as well as, α1a, α1b and α1d receptor, GPRC6A and aromatase (urethra), we’re not detectable. As
a whole, our results seem indicate that in physiological condition androgens favors the filling bladder by relaxing of bladder and contraction of the urethra through non-genomic mechanisms. In OVX, the androgens are able to normalize the hypoactive bladder condition, promoting bladder empty, which is done incrementing of bladder contraction and reducing urethral contraction, both depending of the activation of classic genomic mechanisms. Thus, understanding the mechanism of action of androgens in the lower urinary tract will allow us to suggest hormonal replacement with androgens as a therapeutic alternative for urological complications in the post menopause.
Key words: Testosterone, 5α-dihydrotestosterone, 5α-reductase, ovariectomy, Type-L calcium
RESUMEN
La disminución hormonal conlleva a lo que llamamos de síndrome genitourinaria en la
menopausia (SGM), que comprende, entre otros factores, síntomas del tracto urinario inferior
(STUI) como aumento de la frecuencia urinaria, urgencia, nocturia e incontinencia urinaria, los cuales impactan negativamente la calidad de vida e interacción social de la persona. La terapia de reemplazo hormonal con testosterona se ha utilizado en mujeres posmenopáusicas para aliviar ciertos síntomas de la deficiencia de andrógenos como la pérdida de la líbido, pérdida de masa musculoesquelética y función cognitiva. Sin embargo, pocos estudios se han enfocado en la comprensión de los efectos de este reemplazo hormonal androgénico en la disfunción miccional en la posmenopausia. Estudio previo de nuestro grupo evaluó los efectos del reemplazo hormonal con testosterona en la disfunción miccional de ratas, después de 4 meses de ovariectomia (OVX). La reducción hormonal provocó alteraciones miccionales in vivo (aumento de la frecuencia miccional y de las presiones basal, umbral y posmiccional), así como hipocontractilidad de la vejiga e hipercontractilidad de la uretra in vitro, las cuales fueron revertidas por el andrógeno en dosis suprafisiológicas. Estos efectos protectores de la testosterona se mostraron independientes de la síntesis de estrógeno, ya que los efectos permanecieron presentes aún después del tratamiento de los animales con letrozol (inhibidor de la aromatización de la testosterona). No obstante, todavía no conocemos el mecanismo de acción de los andrógenos en la musculatura lisa del tracto urinario inferior (vejiga y uretra) en condiciones fisiológicas y patológicas (OVX) y, aún sin saber si es resultado de la activación de mecanismos genómicos, no genómicos o ambos. Nuestros resultados mostraron que la preincubación in vitro con los andrógenos (testosterona y/o 5α-dihidrotestosterona) provoca respuestas diferentes dependiendo de la condición experimental y del tejido. En la vejiga de ratas control, los andrógenos (100 nM) redujeron significativamente las respuestas contráctiles al carbacol y estímulo eléctrico (P < 0.05), sin modificar la del cloruro de calcio (CaCl2). En la
uretra de los animales control, la testosterona aumentó la respuesta contráctil a la fenilefrina (P < 0.05), sin modificar la contracción inducida por CaCl2. Las respuestas relajantes de la vejiga
causadas por isoproterenol, mirabegrón y nitroprusiato de sodio (SNP) en la uretra, no fueron modificadas significativamente por la testosterona. En los animales control, la preincubación de los tejidos con flutamida (bloqueador del receptor nuclear de andrógeno) no modificó los efectos vesicales y uretrales de los andrógenos. Diferente de la condición fisiológica, en ratas ovariectomizadas los andrógenos revirtieron tanto la hipocontractilidad vesical al carbacol
como la hipercontractilidad uretral a fenilefrina y CaCl2 (P < 0.05). Además, en ratas
ovariectomizadas, la flutamida previno totalmente los efectos de los andrógenos en la vejiga y uretra. Con relación a los mecanismos relajantes en la uretra, notamos que la OVX potencializó, a nivel de pEC50, el efecto relajante del SNP. Finalmente, los datos de RT-PCR en la vejiga
mostraron que la OVX no modifica la expresión de los receptores M2 y M3, L-VOCC, AR y
5a-reductase, pero redujo significativamente la expresión del receptor β3-adrenérgico. En la
uretra, la OVX aumentó la expresión de AR, de 5a-reductase, L-VOCC y nNOS. El receptor β2-adrenérgico, GPRC6A y aromatasa (vejiga), asi como los receptores α1a, α1b, α1d, GPRC6A
y aromatasa (uretra), no fueron detectables. En conjunto, nuestros datos parecen indicar que en la condición fisiológica, los andrógenos favorecen la fase de llenado al relajar la vejiga y contraer la uretra, a través de mecanismos no genómicos. En la OVX, los andrógenos son capaces de normalizar el cuadro de vejiga hipoactiva, promoviendo la evacuación de la vejiga, debido al aumento de la contracción de la vejiga y reducción de la contracción uretral, ambos dependientes de la activación de mecanismos genómicos clásicos. De esta manera, comprendiendo el mecanismo de acción de los androgenos en el tracto urinario inferior, será posible sugerir el reemplazo hormonal con andrógenos como alternativa terapéutica para las complicaciones urológicas en la posmenopausia.
Palabras clave: Testosterona, 5α-dihidrotestosterona, 5α-reductasa, ovariectomía, canales de
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Esquema ilustrativo da anatomia do trato urinário inferior (bexiga urinária e uretra).
... - 28 -
Figura 2. Esquema ilustrativo do controle neuronal e inervação do trato urinário inferior.- 29 - Figura 3. Mecanismo de contração (A) e relaxamento (B) na bexiga urinária ... - 31 -
Figura 4. Mecanismo de contração (A) e relaxamento (B) na uretra. ... - 32 -
Figura 5. Principais locais de produção de andrógenos na mulher. ... - 35 -
Figura 6. Vias de sinalização dos andrógenos.. ... - 38 -
figura 7. Linha de tempo do modelo de ovariectomia. ... - 45 -
Figura 8. Respostas contráteis da bexiga de ratas controle ao carbacol (CCh) e estimulação elétrica (frequência) na presença de testosterona ou 5α-dihidrotestosterona (30 min) ... - 53 -
Figura 9. Efeito da flutamida (1 µM, 1 h) e testosterona (100 nM, 1 h) nas respostas contráteis ao carbacol (A) e estimulação elétrica (B) em bexigas isoladas de ratas controle. ... - 54 -
Figura 10. Efeito da testosterona 3-(O-carboximetil)oxima: BSA (T-BSA: 100 nM, 1 h) nas respostas contráteis ao carbacol (A) e estimulação elétrica (B) em bexigas isoladas de ratas controle. ... - 55 -
Figura 11. Efeito da testosterona (30 min) na resposta contrátil da bexiga isolada de ratas controle ao cloreto de cálcio (CaCl2) ... - 56 -
Figura 12. Respostas relaxantes da bexiga à testosterona individualmente, mirabegron e ao isoproterenol... ... - 57 -
Figura 13. Efeito da testosterona e 5α-dihidrotestosterona (5α-DHT) na resposta contrátil à fenilefrina em uretras isoladas de ratas controle. ... - 58 -
Figura 14. Efeito da testosterona e flutamida (1 µM) na resposta contrátil da uretra à fenilefrina. ... - 59 -
Figura 15. Efeito da testosterona 3-(O-carboximetil)oxima: BSA (T-BSA: 100 nM, 1 h) nas respostas contráteis à fenilefrina em uretras isoladas de ratas controle.. ... - 60 -
Figura 16. Efeito da testosterona na resposta contrátil induzida pelo cloreto de cálcio (CaCl2) em uretra de ratas controle. ... - 61 -
Figura 17. Respostas relaxantes da uretra à testosterona individualmente e ao nitroprussiato de sódio (SNP) de ratas controle ... - 62 -
Figura 18. Caracterização morfométrica do modelo de ovariectomia (OVX) bilateral com absortometria de raio-x dupla energia (DEXA). ... - 64 -
Figura 19. Pesos do útero (A), gordura perigonadal (B), bexiga (C) e uretra (D) de ratas Sham
e ovariectomizadas (OVX). ... - 65 -
Figura 20. Respostas contráteis ao carbacol e EFS em bexigas isoladas de ratas
ovariectomizadas (OVX). ... - 66 -
Figura 21. Efeito da testosterona (T) e 5α-dihidrotestosterona (5α-DHT) nas respostas
contráteis ao carbacol e estimulação elétrica (EFS) em bexigas isoladas de ratas OVX. ... - 67 -
Figura 22. Respostas contráteis ao carbacol (A) e estimulação elétrica (B) em bexiga isolada
de ratas OVX na presença de flutamida (1 µM) e/ou testosterona. ... - 68 -
Figura 23. Efeito da testosterona (30 min) na resposta contrátil da bexiga isolada de ratas
ovariectomizadas (OVX) induzida pelo cloreto de cálcio (CaCl2).. ... - 69 - Figura 24. Respostas relaxantes à testosterona, mirabegron e isoproterenol em bexigas de ratas
Sham e ovariectomizadas (OVX).. ... - 71 -
Figura 25. Expressão gênica (mRNA) dos receptores muscarínicos do subtipo M2 (A), M3 (B),
canal de cálcio voltagem-dependente tipo L (L-VOCC; C), receptor β3-adrenergico (D),
receptor de andrógeno (E), enzima 5α-redutase e o gene endógeno RPL37a (G) na bexiga urinária de ratas Sham e OVX. ... - 73 -
Figura 26. Respostas contráteis à fenilefrina e estimulação elétrica em uretra isolada de ratas
Sham e ovariectomizadas (OVX). ... - 74 -
Figura 27. Respostas contráteis à fenilefrina em uretra isolada de ratas ovariectomizadas
(OVX) na presença de testosterona e flutamida (1 µM). ... - 75 -
Figura 28. Efeito da testosterona e nifedipina na resposta contrátil da uretra de ratas
ovariectomizadas (OVX) ao cloreto de cálcio (CaCl2). ... - 76 - Figura 29. Respostas relaxantes da uretra de ratas OVX à testosterona individualmente e ao
nitroprussiato de sódio (SNP). ... - 77 -
Figura 30. Expressão gênica (mRNA) do receptor de andrógeno (A), 5α-redutase (B), óxido
nítrico sintase neuronal (nNOS) (C), canal de cálcio tipo L (D), fosfodiesterase 5 (PDE5; E) e o gene endógeno RPL37a (F) na uretra de ratas Sham e OVX... ... - 78 -
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Estágios do ciclo reprodutivo na mulher ... - 26 - Tabela 2. Iniciadores (primers) utilizados para RT-PCR em bexiga urinária e uretra ... - 50 - Tabela 3. Níveis séricos de estrógeno e testosterona em ratas sham e ovariectomizadas (OVX)
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
§ OVX: Ovariectomia § Sham: Falso-operado § T: Testosterona § 5α-DHT: 5α-dihidrotestosterona § Flu: Flutamida § CCh: Carbacol§ EFS: Estimulação elétrica de campo (do inglês: Electrical-Field Stimulation) § T-BSA: Testosterona 3-(O-carboximetil)oxima: BSA
§ β3: Receptor beta 3 adrenérgico. β2: Receptor beta 2 adrenérgico.
§ AR: Receptor de andrógeno
§ L-VOCC: Canal de cálcio voltagem-dependente tipo L (do inglês: L-type
voltage-dependent calcium channel)
§ CaCl2: Cloreto de cálcio
§ RT-PCR: Reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (do inglês: Reverse
transcription polymerase chain reaction)
§ GPCR6A: Receptor acoplado à proteína G da familia C grupo 6 membro A (do inglês:
G protein coupled receptor Family C group 6 member A)
§ M2/M3: Receptores muscarínicos do subtipo 2 e 3
§ α1: Receptor alfa 1 adrenérgico
§ SNP: Nitroprussiato de sódio § IP: Intraperitoneal
§ NaCl: Cloreto de sódio § KCl: Cloreto de potássio § MgSO4: Sulfato de magnésio
§ KH2PO4: Fosfato de potássio monobásico
§ NaHCO3: Bicarbonato de sódio
§ C6H12O6: Dextrose
§ O2: Molécula de oxigênio
§ CO2: Molécula de dióxido de carbono
§ pD2/ pEC50: Antilog da concentração do agonista que produz 50% da resposta máxima
§ ISO: Isoproterenol § FE: Fenilefrina
§ mRNA: Ácido ribonucleico mensageiro
§ cDNA: Ácido desoxirribonucleico complementário § ANOVA: Análise de variância
§ n: Tamanho amostral
§ E.P.M: Erro padrão da média
§ P < 0,05: Valor mínimo de probabilidade considerado estatisticamente significativo § CPA: Ácido ciclopiazônico
§ DEPC: Pirocarbonato de dietilo
§ SGM: Síndrome Geniturinária na Menopausa (do inglês: GSM: Genitourinary
Syndrome of Menopause)
§ HSPs: Proteínas de choque térmico (do inglês: Heat Shock Protein) § DEXA: Absortometria de raio-X de dupla energia
§ DMSO: Dimetilsulfóxido § ADR: Adrenoceptor
§ ChmrR: Receptor colinérgico muscarínico § RPL37a: Proteína ribosomal L37a
§ TRH: Terapia de reposição hormonal. § ERA: Elementos de resposta androgênicos § NOS: Óxido nítrico sintase
§ c-Src: Proto-oncogene da proteína tirosina quinase Scr
§ RAF-1: Proto-oncogene da proteína serina/treonina quinase RAF
§ ERK: Quinases reguladas por sinal extracelular (do inglês: Extracelular
signal-regulated kinases).
§ MAPK: Proteína quinase ativadas por mitogênio (do inglês: Mitogen-activated protein
kinases).
§ TRMP8: Receptor de potencial transiente melastina do tipo 8. § Akt: Proteína quinase B.
§ PI3K: Fosfaditilinositol 3-quinase.
§ NADPH: Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina. § O2-: Ânion superóxido.
§ ACh: Acetilcolina
LISTA DE SUBSTÂNCIAS
Substância Fabricante Procedência
Cetamina Vencofarma do Brasil Ltda. Londrina-PR, Brasil Xilazina Vencofarma do Brasil Ltda. Londrina-PR, Brasil
Isoflurano Cristália Itapira, SP, Brasil
NaCl Merck Darmstadt, Alemanha
CaCl2 Merck Darmstadt, Alemanha
KCl CAQ- Casa da Química Ind. e
com. Ltda. São Paulo, Brasil
MgSO4 Merck Darmstadt, Alemanha
KH2PO4 Merck Darmstadt, Alemanha
NaHCO3 Merck Darmstadt, Alemanha
Dextrose Mallinckrodt Baker Ed. Do México, México Na2HPO4 Mallinckrodt Baker Ed. Do México, México
Undecanoato de testosterona Bayer Pharma AG Berlim, Alemanha
Flutamida Farmácia Prudente Itatiba, Brasil
Nifedipina Sigma St. Louis, LO, EUA
5α-dihidrotestosterona
(5α-Androstan-17β-ol-3-one) Sigma St. Louis, LO, EUA
Ácido ciclopiazônico Sigma Darmstadt, Alemanha
Álcool 100% LS Chemicals Ribeirão Preto, SP Brasil
Dimetilsulfoxido (DMSO) Sigma St. Louis, LO, EUA
Carbacol Sigma St. Louis, LO, EUA
Fenilefrina Sigma St. Louis, LO, EUA
Testosterona
3-(O-carboximetil)oxima: BSA Sigma St. Louis, LO, EUA
Etilenoglicol-bis (2-amino-etileter)-N,N,N’,N’-acido
tetraacético
Sigma St. Louis, LO, EUA
NaOH Mallinckrodt Baker Ed. Do México, México
TRIzol Thermo Fisher Scientific Massachusetts, EUA
Clorofórmio Sigma St. Louis, LO, EUA
Álcool isopropílico Sigma St. Louis, LO, EUA
Álcool etílico Sigma St. Louis, LO, EUA
Água DEPC Sigma St. Louis, LO, EUA
Água ultrapura Sigma St. Louis, LO, EUA
Turbo DNA-free Kit (RNA) Thermo Fisher Scientific Vilnius, Lithuania High Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit Applied Biosystems Califórnia, EUA
Primer M2, M3 IDT São Paulo, Brasil
Primer β2, β3 IDT São Paulo, Brasil
Primer α1a, α1b, α1d IDT São Paulo, Brasil
Primer AR IDT São Paulo, Brasil
Primer GPRC6A IDT São Paulo, Brasil
Primer canal de cálcio tipo L
(Cacnac1a, Cacnac1d) IDT São Paulo, Brasil
Primer 5α-redutase IDT São Paulo, Brasil
Primer PDE5 Invitrogen Carlsbad, EUA
Primer RPL37a IDT São Paulo, Brasil
Primer nNOS Qiagen Hilden, Alemanha
Primer aromatase IDT São Paulo, Brasil
Isoproterenol Sigma St Louis, LO, EUA
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... - 25 - 1.1. Síndrome geniturinária na menopausa ... - 26 - 1.2. Anatomia, fisiologia e farmacologia do trato urinário inferior feminino (TUI): bexiga urinária e uretra ... - 27 -
1.2.1. Bases fisiológicas e farmacologia do trato urinário inferior ... - 28 - 1.3. Ovariectomia (OVX) bilateral e o impacto sobre o trato urinário inferior ... - 33 - 1.4. Abordagem farmacológica e não-farmacológica, e reposição hormonal para
tratamento dos sintomas do trato urinário inferior (STUI) na mulher ... - 33 - 1.5. Fisiologia dos andrógenos na mulher ... - 34 - 1.5.1. Receptor de andrógeno (AR) e seus efeitos androgênicos ... - 35 - 1.5.1.1. Via de sinalização genômica ... - 36 - 1.5.1.2. Via de sinalização não-genômica ... - 37 - 1.6. Testosterona e o TUI ... - 38 - 1.7. Reposição androgênica na pós-menopausa ... - 39 - 2. JUSTIFICATIVA ... - 41 - 3. OBJETIVOS ... - 42 - 3.1. Objetivo geral do projeto ... - 42 - 3.2. Objetivos específicos do projeto ... - 42 - 4. MATERIAIS E MÉTODOS ... - 44 - 4.1. Animais de experimentação ... - 44 - 4.2. Ovariectomia (OVX) bilateral ... - 44 - 4.3. Composição corporal - densitometria ... - 45 - 4.4. Determinação de parâmetros funcionais in vitro ... - 45 -
4.4.1. Preparação da musculatura lisa da bexiga e construção de curvas concentração-resposta ... - 45 - 4.4.1.1. Estimulação elétrica de campo (Electrical-field Stimulation; EFS) ... - 47 - 4.4.1.2. Análise da resposta relaxante da bexiga ... - 47 -
4.4.2. Preparação da musculatura lisa uretral e construção de curvas concentração-resposta ... - 47 - 4.4.2.1. Análise da resposta relaxante da uretra ... - 48 - 4.5. Determinação de parâmetros moleculares ... - 48 - 4.5.1. Técnica PCR em tempo real (RT – PCR) ... - 48 - 4.6. Análise estatística ... - 51 - 5. RESULTADOS ... - 52 -
5.1. Parte I: Ação farmacológica dos andrógenos na bexiga urinária e uretra de
animais em condição fisiológica (controle) ... - 52 - 5.1.1. Resposta contrátil de bexigas isoladas ... - 52 - 5.1.2. Efeito da testosterona na resposta contrátil da bexiga induzida pelo CaCl2 .... - 55 - 5.1.3. Resposta relaxante das bexigas isoladas ... - 56 - 5.1.4. Respostas contráteis em uretra isoladas ... - 58 -
5.1.5. Efeito da testosterona na resposta contrátil induzida pelo CaCl2 em uretras
isoladas ... - 60 - 5.1.6. Resposta relaxante das uretras isoladas ... - 61 - 5.2. Parte II: Ação farmacológica dos andrógenos na bexiga urinária e uretra de ratas ovariectomizadas (OVX) ... - 62 -
5.2.1. Caracterização morfométrica do modelo de OVX ... - 62 - 5.2.2. Resposta contrátil de bexigas isoladas de ratas OVX ... - 65 - 5.2.3. Efeito da testosterona na resposta contrátil da bexiga induzida pelo CaCl2 .... - 68 - 5.2.4. Efeito da testosterona na resposta relaxante da bexiga em ratas OVX ... - 69 - 5.2.5. Efeito da ovariectomia em parâmetros moleculares na bexiga urinária (expressão gênica) ... - 72 - 5.2.5. Respostas contráteis de uretra isolada de ratas OVX ... - 73 -
5.2.6. Efeito da testosterona na resposta contrátil pelo CaCl2 em uretra isolada de rata
OVX ... - 75 - 5.2.7. Resposta relaxantes das uretras isoladas de ratas OVX ... - 76 - 5.2.8. Efeito da OVX em parâmetros moleculares na uretra de ratas Sham e OVX
(expressão gênica) ... - 77 - 6. DISCUSÃO ... - 79 - 7. SUMÁRIO ... - 87 - 7.1. Efeitos dos andrógenos na bexiga e uretra de ratas controle ... - 87 -
7.2. Efeito dos andrógenos na bexiga e uretra de ratas OVX ... - 88 - 8. CONCLUSÃO ... - 89 - 9. REFERÊNCIAS ... - 90 - 10. ANEXOS ... - 101 - 11. APÊNDICE ... - 104 -
1.
INTRODUÇÃO
O envelhecimento da população em nível mundial tem levado pesquisadores e clínicos a focar seus esforços na população idosa (acima de 60 anos), devido aos desafios de saúde nesta faixa etária (1). O aumento da expectativa de vida da mulher tem gerado um interesse crescente na compreensão do climatério (peri-menopausa) e da pós-menopausa em virtude das suas implicações negativas na qualidade de vida (2).
O ciclo reprodutivo na mulher pode ser classificado como fase reprodutiva, peri-menopausa (ou fase de transição) e, por último pós-peri-menopausa (Tabela 1). Entre a segunda e terceira fase temos a menopausa, definida como o estado biológico da mulher onde há término do período menstrual, seja de forma natural ou cirúrgica, que acontece entre os 40 e 50 anos de idade (3, 4, 5). A pós-menopausa se instala em seguida; nesta fase, há diminuição significativa das concentrações séricas circulantes dos hormônios sexuais (estrógeno, progesterona e andrógenos) e, como consequência dessas baixas concentrações hormonais, acontecem mudanças fisiológicas importantes na mulher como sinais e sintomas vasomotores (fogacho, sudorese), cognitivos (mudanças de humor e doenças neurológicas), cardiovasculares (problemas de coagulação, trombose venosa profunda, hipertensão), musculoesqueléticos (osteoartrite, osteoporose) e vaginais (secura vaginal, prurido, dispareunia). Ao lado destes, sintomas urinários também são observados frequentemente em mulheres na fase tardia da pós-menopausa, notando-se que longos períodos de privação hormonal podem levar a urgência, noctúria, frequência e incontinência urinária (3, 6, 7).
Tabela 1. Estágios do ciclo reprodutivo na mulher
FPM: Fim do período menstrual. Adaptado de Baber et al., 2016.
1.1. Síndrome geniturinária na menopausa
A Síndrome Geniturinária na Menopausa (SGM) (do inglês GSM: Geniturinary
Syndrome of Menopause) compreende sinais e sintomas associados à diminuição hormonal que
afeta o sistema reprodutivo externo (lábia maior/menor), interno (clitóris, vagina, útero) e o sistema urinário (bexiga urinária e uretra) (8). A Sociedade Internacional para o Estudo da Saúde Sexual da Mulher (ISSWSH) e a Sociedade Norte-americana de Menopausa (NAMS) avaliaram a necessidade de estabelecer um termo que permitisse a associação da atrofia vulvovaginal e a sintomatologia urinária, com o intuito de aprimorar uma correta comunicação entre mulheres, profissionais da saúde e pesquisadores, melhorando assim o diagnóstico e tratamento dos sintomas geniturinários (8, 9).
Os sintomas urinários caracterizados como urgência, frequência urinária, noctúria, irritabilidade do meato uretral, sensibilidade uretral e incontinência urinária (9, 10) são chamados também de sintomas do trato urinário inferior (STUI) (do inglês LUTS: Lower
Urinary Tract symptoms) que podem ser divididos em sintomas de armazenamento, de micção
e de pós-micção (7, 11, 12). Estima-se que no ano presente (2020) aproximadamente 889 milhões de mulheres ao nível mundial, na faixa etária entre 50 e 80 anos, terão sintomas da SGM, que afeta as atividades diárias e a qualidade de vida, e que frequentemente são
Estágio
-5 -4 -3b -3a -2 -1 +1a +1b +1c +2
REPRODUTIVA TRANSIÇÃO DA MENOPAUSA PÓS-MENOPAUSA
Inicial Pico Tardia Inicio Tardia Inicio Tardia
PERI-MENOPAUSA
Duração Variável Variável 1-3 anos 2 anos (1+1) 3-6 anos Resto da vida Ciclo
menstrual
Variável
- regular Regular Regular mudanças Sutil às no fluxo Persistente de quantidade variável > 7 dias. Diferença na quantidade em ciclos diferentes Intervalo de amenorreia > 60 dias
Sintomas Sintomasvasomotores
(provável) Sintomas vasomotores (maior probabilidade) Sintomas de atrofia urogenital (aumento) Menarca FPM (0)
subnotificadas (9, 13, 14). A SGM pode avançar de forma crônica e progressiva quando não se tem o tratamento adequado (7, 8, 9).
As baixas concentrações circulantes dos hormônios sexuais femininos, principalmente de estrógeno, aparecem como a origem dos sintomas urinários na SGM, assim como do envelhecimento do trato urinário inferior (TUI) associados ao envelhecimento da mulher (7). No entanto, existem outros fatores de risco como obesidade, hipertensão, diabetes, disfunção do assoalho pélvico, cirurgias ginecológicas, parto, entre outros que podem acarretar o desenvolvimento de sintomas urinários na SGM (15). Entretanto, existem poucos estudos focados no entendimento da etiologia e fisiopatologia dos STUI decorrentes da privação hormonal.
1.2. Anatomia, fisiologia e farmacologia do trato urinário inferior feminino (TUI): bexiga urinária e uretra
O TUI é constituído pela bexiga urinária, uretra e esfíncter uretral externo. A bexiga urinária pode ser dividida em três seções: Domo, trígono e base da bexiga. A parede da bexiga, por sua vez, é constituída por três camadas celulares bem definidas: mucosa, muscularis própria (detrusor) e a serosa/adventícia. A mucosa, que contém urotélio, membrana basal e lâmina própria, tem a função de barreira urotelial; adicionalmente, o urotélio participa do ciclo miccional através da liberação de neurotransmissores contráteis, contribuindo na eliminação da urina (16, 17). Por sua parte, a lâmina própria é composta por matriz extracelular e contém fibroblastos, adipócitos, células intersticiais e nervos sensoriais, cuja função é a de delimitar a complacência e mudanças adaptativas da bexiga relacionadas ao aumento de volume da urina. Na lâmina própria há também células densas, chamadas heterogeneamente como células intersticiais, células intersticiais de Cajal, miofibroblastos ou telócitos, cujas funções no armazenamento e eliminação da urina ainda não foram claramente elucidadas.
O detrusor é a principal estrutura de musculatura lisa, sendo constituído por fibras musculares orientadas em três camadas: longitudinal interna, circunferencial média e longitudinal externa, que levam também à formação do esfíncter próximo ao colo da bexiga (16). O detrusor tem a capacidade de armazenar a urina sem aumentar a pressão intravesical e, posteriormente, contrai-se para gerar uma pressão adequada que permitirá a eliminação da
urina. Por último, a parte externa da bexiga urinária está revestida pela serosa e parte da fascia (16, 18) (Figura 1).
Por outro lado, a uretra se estende desde o esfíncter uretral interno próximo do colo vesical até o exterior, tendo como função a comunicação da bexiga urinária com o ambiente externo e a eliminação da urina. A uretra se subdivide em três regiões: proximal, média e distal (19). Por sua vez, a parede uretral é constituída por uma camada mucosa, submucosa, musculatura lisa (longitudinal lisa e circular média), musculatura estriada externa e tecido conectivo (19, 20, 21, 22). O esfíncter uretral interno, considerado uma extensão do músculo detrusor por encontrar-se próximo do colo da bexiga, favorece o fechamento uretral (16). Adicionalmente, a musculatura estriada ao redor da porção proximal constitui o esfíncter uretral externo (rabdo-esfíncter), que ajuda no fechamento voluntário da uretra na fase enchimento (16, 23, 24). (Figura 1).
Figura 1. Esquema ilustrativo da anatomia do trato urinário inferior (bexiga urinária e uretra). Ilustração feita em BioRender.com.
1.2.1. Bases fisiológicas e farmacologia do trato urinário inferior
No estado fisiológico, há uma coordenação perfeita entre o sistema nervoso central (cérebro e medula espinhal), sistema nervoso periférico autonômico e somático (gânglios, fibras simpáticas, parassimpáticas e nervo pudendo) e os órgãos do TUI, através de estímulos
Urotélio Lâmina própria Músculo detrusor Gordura Domo da bexiga Ureter Trígono Base da bexiga
Esfíncter uretral externo Musculatura lisa uretral
Lúmen Urotélio di st al m édi a pr oxim al Uretra Submucosa Tecido conectivo
aferentes e eferentes que determinam o ciclo miccional de armazenamento e eliminação da urina (16, 22, 25) (Figura 2).
Figura 2. Esquema ilustrativo do controle neuronal e inervação do trato urinário inferior. Ilustração feita em BioRender.com.
O TUI é inervado pelos nervos simpáticos (nervo hipogástrico), parassimpático (nervo pélvico) e somático (nervo pudendo), os quais localizam-se na região toracolombar e sacral da medula espinhal, respectivamente (25) (Figura 2).
Na fase de esvaziamento vesical, o mecanismo de contração predominante na bexiga urinária envolve a liberação de acetilcolina (ACh) dos terminais parassimpáticos e ativação pós-sináptica de receptores muscarínicos, principalmente do subtipo M3 (26). Este receptor está
acoplado à proteína Gq que ativa a fosfolipase C (PLC), favorecendo a geração de
fosfatidilinositol 4,5 bis-fosfato (PIP2), e os segundos mensageiros, diacilglicerol (DAG) e
inositol 1,4,5 tri-fosfato (IP3). O IP3 ativa receptores específicos na membrana do retículo
sarcoplasmático (IP3R), aumentando a concentração de cálcio intracelular ([Ca2+]i). O
complexo Ca2+-calmodulina tem a capacidade de ativar a quinase de cadeia leve de miosina Centro de micção pontino Região toracolombar Fibras do nervo pudendo Fibras do nervo pélvico Fibras no nervo hipogástrico Simpático Parasimpático Somático Região sacral S2-S4 T11-L2 Músculo detrusor Musculatura lisa uretral Músculo detrusor Esfíncter uretral externo
(MLCK; myosin light-chain kinase), levando ao aumento da fosforilação de cadeia leve de miosina tipo II (MLC; myosin light chain), permitindo a união miosina-actina (27), tendo como resultado a contração da musculatura lisa. Ao mesmo tempo, DAG ativa a proteína quinase C (PKC), que fosforila a fosfatase de cadeia leve de miosina (MLCP; myosin light chain
phosphatase), promovendo inativação da mesma, contribuindo para a contração do tecido
vesical (25). Além disso, o aumento da concentração de Ca2+[i] a partir da ativação do receptor
M3 promove o influxo de Ca2+ através de canais de cálcio voltagem-dependente tipo L
(L-VOCC) presentes na membrana celular (27). Dessa forma, o influxo extracelular de cálcio é importante para as respostas contráteis da bexiga, pois estas deixam de ser observadas na presença de bloqueadores de L-VOCC (28). De outra parte, a estimulação do nervo parassimpático também promove a liberação de outros neurotransmissores, como trifosfato de adenosina (ATP), que contribui para a fase de eliminação da urina. O ATP atua por meio da ativação dos receptores P2X no detrusor e/ou P2Y no urotélio. Este nucleotídeo também é
liberado pelas células uroteliais como produto da distensão da bexiga durante a fase de armazenamento (17, 29) (Figura 3A).
Na fase de armazenamento de urina, a ativação de nervos simpáticos na bexiga induz a liberação de noradrenalina, promovendo relaxamento do detrusor por meio da ativação de receptores beta-adrenérgicos, principalmente do subtipo β3. Este receptor se encontra acoplado
à proteína Gs e sua sinalização envolve a ativação da adenilil ciclase solúvel (ACs) e
consequentemente o aumento das concentrações de monofosfato cíclico de adenosina (AMPc), que por sua vez ativa a proteína quinase dependente de AMPc (PKA). Esta proteína leva à fosforilação da MLC, reduzindo a formação do complexo Ca2+-calmodulina. O aumento de
AMPc leva à redução de Ca2+ citoplasmático por meio da sua remoção pelo retículo
sarcoplasmático (30, 31). Outros mecanismos que facilitam a relaxamento da bexiga envolvem a ativação de canais de potássio voltagem-dependentes, os quais são expressos em níveis elevados na musculatura lisa vesical, e quando ativados induzem hiperpolarização e relaxamento tecidual (32) (Figura 3B).
Figura 3. Mecanismo de contração (A) e relaxamento (B) na bexiga urinária. ACh: Acetilcolina; M2/M3: Receptores muscarínicos; Gq: Proteína Gq; PLC: Fosfolipase C; PIP2: Fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato; IP3: Inositol 1,4,5 tri-fosfato; DAG: Diacilglicerol; PKC: Proteína quinase C; Ca2+: Cálcio; K+: Potássio; 𝛃2/𝛃3: Receptores beta-adrenérgicos; Gs: Proteína Gs; NA: Noradrenalina; AC: Adenilil ciclase; ATP: Trisfosfato de adenosina; AMPc: Monofosfato cíclico de adenosina; PKA: Proteína quinase dependente de AMPc; P: fosforilação.
Na musculatura lisa uretral, a densidade de fibras simpáticas é marcantemente maior do que no corpo da bexiga. O subtipo de adrenoceptor mais expresso na uretra humana e de animais é o α1A, que se encontra acoplado à proteína Gq e promove a ativação da PLC, levando à geração
de IP3 e DAG de maneira similar à descrita na bexiga urinária (Figura 4A). Sabe-se que estes
adrenoceptores são muito mais expressos em uretra de macho do que fêmea (33), e isso provavelmente explica a incidência maior de incontinência de esforço na mulher do que no homem (34).
Em relação aos mecanismos relaxantes da uretra, o óxido nítrico (NO) é o principal neurotransmissor não-adrenérgico não-colinérgico (NANC) liberado pelas fibras nitrérgicas localizadas na musculatura lisa detrusora e uretral (35, 36). O NO é formado pela óxido nítrico sintase (NOS), enzima catalítica que se expressa nos diferentes tecidos do organismo como isoforma constitutiva endotelial (eNOS) e neuronal (nNOS), assim como isoforma induzível (iNOS). Entretanto, na musculatura lisa do TUI, a nNOS é de longe a mais relevante para a micção (36). Extracelular Receptor M2/M3 Canal Ca2+ voltagem-dependente tipo L Receptor !2/!3 Gq PIP2 IP3R Retículo endoplasmático Ca2+ Intracelular Ca2+- Calmodulina Miosina quinase Cadeia leve de miosina II Contração IP3 DAG Ca2+ Ca2+ Ca2+ PKC Fosfatase de cadeia leve de miosina II Gs (-) ACh NA (+) AC ATP AMPc PKA Cadeia leve de miosina II Relaxamento Fosfatase de cadeia leve de miosina II (+) p p Fase de
eliminação armazenamentoFase de
p pp α2D N V " Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
A)
B)
Ca2+ Ca2+(-) K+ K+ Extracelular Receptor M2/M3 Canal Ca2+ voltagem-dependente tipo L Receptor !2/!3 Gq PIP2 IP3R Retículo endoplasmático Ca2+ Intracelular Ca2+- Calmodulina Miosina quinase Cadeia leve de miosina II Contração IP3 DAG Ca2+ Ca2+ Ca2+ PKC Fosfatase de cadeia leve de miosina II Gs (-) ACh NA (+) AC ATP AMPc PKA Cadeia leve de miosina II Relaxamento Fosfatase de cadeia leve de miosina II (+) p p Fase deeliminação armazenamentoFase de
p pp α2D N V " Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
A)
B)
Ca2+ Ca2+(-) K+ K+Durante a fase de esvaziamento, o NO ativa a enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), possibilitando a conversão de trifosfato de guanosina (GTP) em monofosfato cíclico de guanosina (GMPc). O acúmulo de GMPc ativa a proteína quinase dependente de GMPc (PKG), levando a relaxamento tecidual principalmente pela diminuição da liberação de Ca2+ do retículo
sarcoplasmático. A PKG pode também ativar indiretamente canais de potássio dependentes de cálcio (BK), causando hiperpolarização (37, 38) (Figura 4B). O GMPc é metabolizado pela fosfodiesterase 5 (PDE5) em GMP reduzindo o acúmulo do nucleotídeo, cessando assim o relaxamento (39).
Por último, o esfíncter uretral externo é inervado diretamente por axônios originados no motoneurônio da medula espinhal no núcleo de Onuf’s que contrai em resposta ao aumento de estímulos simpáticos e somáticos (22, 24).
Figura 4. Mecanismo de contração (A) e relaxamento (B) na uretra. NA: Noradrenalina; α1: Receptor alfa 1-adrenérgico; Gq: Proteína Gq; PLC: Fosfolipase C; PIP2: Fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato; IP3: Inositol 1,4,5 tri-fosfato; DAG: Diacilglicerol; PKC: Proteína quinase C; Ca2+: Cálcio; K+: Potássio; NO: Óxido nítrico; GCs: Guanilato ciclase solúvel; GTP: Trifosfato de guanosina; GMPc: Monofosfato cíclico de guanosina; GMP: Monofosfato de guanosina; PKG: Proteína quinase dependente de GMPc; PDE5: Fosfodiesterase 5; P: fosforilação.
Relaxamento Extracelular Canal Ca2+ voltagem-dependente tipo L PIP2 IP3R Retículo endoplasmático Ca2+ Intracelular Ca2+- Calmodulina Miosina quinase Cadeia leve de miosina II Contração IP3 DAG Ca2+ Ca2+ Ca2+ PKC Fosfatase de cadeia leve de miosina II (-) (+) Fase de
armazenamento eliminaçãoFase de
p p p α2D N V ! Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
A)
B)
Receptor α1 NA NO GCs Estado reduzido GTP GMPc " # 2+ PKG Fosfatase de cadeia leve de miosina II (+) p p Fibras nitrérgicas PDE5 GMP K+ K+ K+ K+ Ca2+ Ca2+(-) Relaxamento Extracelular Canal Ca2+ voltagem-dependente tipo L PLC PIP2 IP3R Retículo endoplasmático Ca2+ Intracelular Ca2+- Calmodulina Miosina quinase p p Cadeia leve de miosina II Contração IP3 DAG Ca2+ Ca2+ Ca2+ PKC Fosfatase de cadeia leve de miosina II (-) (+) Fase dearmazenamento eliminaçãoFase de
p p p α2D N V ! Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
A)
B)
Receptor α1 Gq NA NO GCs Estado reduzido GTP GMPc ! " 2+ PKG Fosfatase de cadeia leve de miosina II (+) p p Fibras nitrérgicas PDE5 GMP K+ K+ K+ K+ C ana l K + vol tage m -de pe nde nte Ca2+ Ca2+(-)1.3. Ovariectomia (OVX) bilateral e o impacto sobre o trato urinário inferior
Na pesquisa básica, o modelo de OVX bilateral é amplamente utilizado para mimetizar clinicamente a falência ovariana precoce que leva à diminuição dos hormônios sexuais femininos ovarianos e mudanças morfométricas nos órgãos reprodutivos como atrofia do útero, clitóris e vagina (40, 41). A falência ovariana é amplamente conhecida por sua repercussão no sistema cardiovascular (42,43), acarretando hipertensão arterial devido principalmente à disfunção endotelial (44, 45). A falência ovariana precoce leva também a alterações do TUI, manifestando-se como instabilidade do esfíncter uretral externo e do detrusor, resultando em diminuição da capacidade da bexiga e da eficácia da micção (10). Estudos prévios mostraram que alterações da contratilidade vesical decorrentes da OVX podem variar de acordo com o tempo de privação hormonal, podendo-se observar tanto hiperatividade vesical em poucas semanas (46) ou hipocontratilidade após longos períodos de declínio hormonal (47, 48). Estas alterações podem estar relacionadas a mudanças na distribuição de colágeno/elastina as quais afetam as propriedades mecânicas do TUI (49) ou à diminuição da sensibilidade da bexiga (50).
1.4. Abordagem farmacológica, não-farmacológica e reposição hormonal para tratamento dos sintomas do trato urinário inferior (STUI) na mulher
A abordagem clínica dos STUI visa melhorar as alterações miccionais por meio de agentes farmacológicos, como os antimuscarínicos M3 (tolterodina, trospium, oxibutinina), que
reduzem a contratilidade vesical, promovendo aumento da capacidade vesical (51, 52). No entanto, o uso continuado destes fármacos acarreta efeitos colaterais como boca seca, visão turva e constipação, diminuindo a aderência ao tratamento. Mais recentemente, lançou-se na clínica o mirabegron (YM178), agonista seletivo para adrenoceptores β3 (53), sendo o primeiro
medicamento dessa classe aprovado para o tratamento de bexiga hiperativa (54, 55). O mirabegron induz relaxamento vesical aumentando a capacidade da bexiga, e melhorando assim a eficácia da micção, inclusive em mulheres de idade avançada (56). Estudos clínicos mostraram que o tratamento com mirabegron resulta em menor incidência de efeitos colaterais comparado aos antimuscarínicos (54, 55).
Tratamentos não-farmacológico também são utilizados com o intuito de melhorar os sintomas urinários e a qualidade de vida da paciente. Estes incluem homeopatia, mudanças no estilo de vida e fisioterapia (terapia de Kegel). (7, 57).
A Sociedade Internacional de Menopausa (International Menopause Society) recomenda a terapia de reposição hormonal (TRH) com estrógeno sintético para o tratamento dos sintomas associados à diminuição hormonal uma vez que seus efeitos estão bem estabelecidos (3, 58). Entretanto, pesquisas sobre a influência de outros hormônios nesses sintomas são negligenciados (59). A TRH com estrógeno vem também sendo pensada para o tratamento dos STUI (10). Porém, há ainda poucos estudos recomendando o uso deste hormônio para a desordem miccional, pois pode inclusive piorar o quadro clínico e mesmo acelerar o desenvolvimento da incontinência urinária (4, 60). Em ratas ovariectomizadas, estudo prévio mostrou que a TRH com estrógeno por 16 semanas não mostrou diferença significativa no aumento das pressões basal, limiar e de micção, assim como da frequência miccional (40). Por isso, alternativa à TRH clássica, usando-se andrógenos, vem sendo explorada nos últimos anos para tratamento dos sintomas urinários na mulher em menopausa.
1.5. Fisiologia dos andrógenos na mulher
Na mulher, a testosterona é o esteroide mais importante do grupo dos andrógenos, sendo produzida principalmente nos ovários e glândulas adrenais, sendo que após a menopausa as adrenais passam a ser a principal fonte produtora dos mesmos (61) (Figura 5).
A maior parte dos estudos classifica os andrógenos como hormônios masculinos uma vez que os níveis circulantes destes hormônios no homem são muito mais elevados quando comparados ao das mulheres. Porém, da segunda para a terceira década da vida da mulher, as concentrações plasmáticas de testosterona e de seus precursores androgênicos, como dihidroepiandrosterona (DHEA), dihidroepiandrosterona sulfato (DHEA-S) e androstenediona (A4), tornam-se elevados, tornando-se quantitativamente mais abundantes nesta etapa reprodutiva em particular (62).
Os tecidos periféricos não reprodutivos têm a capacidade de converter a DHEA-S em DHEA seguido da androstenediona, e este em estrona e testosterona. Em seguida, a testosterona pode ser metabolizada pela enzima 5α-redutase, produzindo o metabólito ativo não-aromatizável, 5α-dihidrotestosterona (5α-DHT), ou ser metabolizada pela enzima aromatase (CYP19), resultando na formação de estradiol (E2) (61). Na pós-menopausa, a produção de
como o tecido adiposo. Dessa forma, na mulher os andrógenos são esteroides importantes para a biossíntese de estrógenos (63, 64).
Figura 5. Principais locais de produção de andrógenos na mulher.
A testosterona e 5α-DHT são consideradas os andrógenos mais potentes. Não obstante, o 5α-DHT é três vezes mais potente do que a testosterona em relação à sua afinidade com o receptor de andrógeno (AR), sendo que seus níveis circulantes se correlacionam às concentrações séricas do seu precursor (61). Recentemente, foi descrita a biossíntese de novos esteroides C19 11-oxigenados (11-cetotestosterona e 11-cetodihidrotestosterona) os quais têm afinidade pelo AR similar à testosterona e 5α-DHT, porém seu efeito na mulher ainda não foi estudado (65).
1.5.1. Receptor de andrógeno (AR) e seus efeitos androgênicos
O AR pertence à superfamília de receptores nucleares, contendo domínios estruturais específicos que definem sua ação molecular como fator de transcrição (66, 67). Duas isoformas do AR, referidas como AR-A e AR-B, foram descritas em diferentes tecidos, sugerindo que os andrógenos desempenham efeitos biológicos além daqueles ligados à função sexual (62, 68). Estes incluem proliferação celular, diferenciação, apoptose, secreção de proteínas em tecidos
dependentes de andrógenos (como próstata), e manutenção e homeostase de tecidos não-reprodutivos (69).
O AR pode estar localizado no citoplasma ou na membrana plasmática, e quando ativado interage com elementos de resposta a andrógenos (ERA) na região regulatória do DNA para ativar ou reprimir a transcrição gênica (67). Além deste mecanismo genômico de ação, há evidências da ativação de mecanismos não-genômicos do AR, que levam à ativação de vias de sinalização diferentes daquelas da transcrição (66).
1.5.1.1. Via de sinalização genômica
O AR, na ausência do hormônio, encontra-se no citoplasma no seu estado inativo em associação a proteínas de choque térmico (heat-shock proteins; HSP), proteínas do citoesqueleto e outras (69,70) que modulam a conformação do receptor para ter uma ligação mais eficiente ao hormônio. A união do andrógeno ao AR provoca a dissociação do receptor das HSP, e mobilização do complexo hormônio-receptor ao núcleo celular onde haverá heterodimerização do receptor, facilitando sua ligação aos ERAs. A ligação do complexo hormônio-receptor aos ERAs, permite o recrutamento de enzimas histona acetiltransferase (HAT), uma variedade de co-reguladores e mecanismo geral de transcrição, desencadeando a transcrição de genes dependentes de andrógenos e subsequentemente a síntese proteica (66, 67,69). Esta via de sinalização é classicamente conhecida como “via genômica” e se caracteriza por mediar as respostas biológicas resultantes de longos períodos de exposição ao esteroide (Figura 6A).
Até o momento, na musculatura lisa do TUI não existe informação sobre o mecanismo genômico da testosterona. Os dados disponíveis referem-se mais à musculatura lisa vascular na qual há evidências que, dependendo dos níveis séricos e tempo de exposição, a testosterona poder levar a hipertrofia cardíaca e hipertensão arterial por meio da sinalização genômica (71, 72). O AR tem relação direta com a calcificação da célula muscular lisa vascular devido à interação dos ERAs com a região promotora do gene Gas6, responsável pela diminuição da calcificação vascular (73). A restauração da via de sinalização do Gas6 pela testosterona diminui a calcificação vascular, sendo este efeito prevenido pela flutamida, antagonista de AR intracelular (73). Além disso, a suplementação de testosterona restaura o fluxo sanguíneo da
artéria pudenda interna em ratos orquidectomizados (74), sugerindo que andrógenos possam desempenhar efeitos protetores mediante mecanismos genômicos em diferentes tecidos.
1.5.1.2. Via de sinalização não-genômica
Existem evidências cada vez mais fortes que os andrógenos atuam também por mecanismos “não-genômicos”, uma vez que a exposição aguda a este hormônio leva a respostas rápidas (com latência de segundos a minutos) em certos tecidos, os quais são resistentes à ação de inibidores da transcrição e transdução (66, 75). Estas respostas podem ser observadas inclusive com andrógenos ligados a moléculas como a albumina sérica bovina (BSA), estratégia que previne a mobilização do andrógeno ao citoplasma (76). Identificou-se um receptor de membrana acoplado à proteína G, sensível à toxina pertussis e ao cálcio, que medeia efeitos não-genômicos de andrógenos, referido como GPRC6A (77). Este receptor estimula a cascata de segundos mensageiros que inclui ativação de PLC, influxo de Ca2+, fosforilação do c-Src,
Ras-Raf 1, ERK e ativação da PKC, PKA e MAPK (75, 76). Outras respostas decorrentes da ativação do mecanismo não-genômico incluem efeitos pró-oxidantes, como aumento dos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) por amplificação da expressão e atividade da NAD(P)H-oxidase (subunidades p47phox e gp91phox), assim como diminuição da expressão da eNOS e da
biodisponibilidade de NO (72). Além disso, existem evidências que o receptor TRMP8 (receptor de potencial transiente melastatina do tipo 8) possa atuar como receptor de andrógeno, cuja ativação leva a incremento dos níveis intracelulares de Ca2+ (78, 79). Evidências atuais no
sistema cardiovascular mostram que a testosterona, em concentrações da ordem nanomolar, exerce efeito não-genômico caracterizado por hipotensão sistêmica, possivelmente por ações indiretas decorrentes da ativação da via NO-GCs-GMPc no endotélio e/ou pela diminuição do influxo de Ca2+ (80). No entanto, em concentrações na ordem micromolar, a testosterona
promove vasoconstrição devido à abertura de L-VOCC, aumentando a entrada de cálcio extracelular (80, 81). A testosterona é ainda capaz de ativar canais de potássio voltagem-dependentes ou sensíveis ao cálcio, aumentando o efluxo de K+, provocando hiperpolarização
Figura 6. Vias de sinalização dos andrógenos. 1) Via de sinalização genômica: Os andrógenos atravessam a membrana plasmática; no citoplasma, o AR se dissocia das HPS e se une ao hormônio e o complexo se desloca para o núcleo. 2) via de sinalização não-genômica: (a) Andrógenos ativam a via PLC levando à formação de IP3 e DAG, resultando em aumento de Ca2+[i] e ativação da PKC; (b) União andrógeno-GPCR6A ativa a via PI3K-PKC-Scr; (c) Andrógenos promovem a produção de EROs pela NAD(P)H oxidase; (d) Andrógenos bloqueiam canais de cálcio voltagem-dependentes tipo L (L-VOCC) provocando relaxamento; (e) Andrógenos ativam L-VOCC aumentando Ca2+
[i] levando à contração via PKA-MAPK; (f) Andrógenos ativam canais de potássio voltagem-dependente provocando efluxo de K+; (g) União andrógeno-TRPM8 leva ao aumento de Ca2+[i]. AR: Receptor de andrógeno; HSP: Proteínas de choque térmico; ERA: Elementos de resposta a andrógenos; PLC: Fosfolipase C; IP3: Inositol 1,4,5 tri-fosfato; DAG: Diacilglicerol; PKC: Proteína quinase C; Ca2+: Cálcio; K+: Potássio; PKA: Proteína quinase dependente de APMc; eNOS: Óxido nítrico endotelial; NO: Óxido nítrico; TRPM8: Receptor de potencial transiente melastatina do tipo 8; MAPK: Proteínas quinase ativada por mitógeno; ERK: Quinases reguladas por sinal extracelular; GPCR6A: Receptor acoplado à proteína G da família C grupo 6 membro A; P: fosforilação; Akt: Proteína quinase B; PI3K: Fosfaditilinositol 3-quinase; Scr: Proto-oncogene da proteína tirosina quinase Scr; NADPH: Fosfato de dinucleótido de adenina e nicotinamida; O2-: Ânion superóxido. Adaptado de Lucas-Herald et al., 2017.
1.6. Testosterona e o TUI
Estudos prévios avaliaram a expressão do AR na bexiga de humanos (83) e animais (84, 85). Basicamente, detectou-se mRNA do AR no urotélio e na submucosa da bexiga urinária de humanos e de roedores. A presença do AR no TUI sugere que os andrógenos possam exercer papel importante na fisiologia deste sistema, embora possam também estar relacionados com o desenvolvimento de câncer de bexiga (86). Alguns estudos mostram que homens têm de três a quatro mais probabilidade de ter câncer de bexiga do que mulheres (86, 87, 88), e, de fato,
Influxo de Ca2+ PLC IP3 DAG PKC Ca2+[i] GPRC6A PI3K PKC Src pERK1/2 Canal Ca2+ tipo L voltagem-dependente Relaxamento Influxo de Ca2+ Bloqueio de influxo de Ca2+ Ca2+[i] Ca2+ -calmodulina PKA MAPK PKC Canal K+ voltagem-dependente Efluxo de K+ Relaxamento Extracelular Intracelular eNOS NO
RESPOSTA GENÔMICA RESPOSTA NÃO-GENÔMICA
Andrógenos (+) Retículo sarcoplasmático pAKT p22 Nox1 ou Nox4 P47 phox P67 phox Bac NAD(P)H O2 -(+) TRPM8 Ca2+ [i] (1) (2) (a) (b) (c) (g) (d) (e) (f) AR HSP90 HSP70 HSP40 TBP CTF HTA GTF RNA pol II ERA Núcleo AR Fatores de transcrição Síntese de proteínas AR
estudos pré-clínicos já evidenciaram que o AR desempenha função importante na progressão da carcinogênese vesical (89).
Existe ainda uma relação entre os receptores muscarínicos e andrógenos em tecidos reprodutivos de machos (90). A orquiectomia bilateral provoca regulação negativa na expressão do mRNA e nível proteico basal de receptores muscarínicos M2 e M3 nas diferentes porções do
epidídimo, sendo esta revertida pela reposição hormonal com testosterona. Por outro lado, o tratamento hormonal com testosterona leva à regulação positiva na expressão de mRNA de receptores muscarínicos em bexiga urinária de macho após a castração (91). Entretanto, no geral, ainda há poucos estudos abordando a modulação da resposta miccional pelos andrógenos/AR na mulher em condição fisiológica ou de privação deste hormônio (menopausa). No geral, estudos experimentais em fêmeas mostram que andrógenos/AR contribuem para a manutenção da função miccional (46, 48). No entanto, ainda não se sabe se no TUI a testosterona atua por mecanismos genômicos, não-genômicos ou ambos.
1.7. Reposição androgênica na pós-menopausa
Na pós-menopausa há redução significativa das concentrações séricas circulantes de andrógenos ocasionada pela própria idade ou pela remoção dos ovários (92). Dessa forma, o tratamento da insuficiência androgênica nestas condições é geralmente feito à base de reposição de andrógeno (61). Propõe-se como insuficiência androgênica na pós-menopausa sintomas como a falta de motivação e presença de fadiga, mal-estar, transtornos do humor e disfunção sexual, havendo ainda diminuição de massa muscular e perda óssea (93, 94, 95). É ainda comum na mulher pós-menopausada a presença de complicações miccionais (aumento da frequência miccional, urgência, noctúria e incontinência urinária), que embora muito evidentes na clínica são pouco estudadas quanto à fisiopatologia (96).
A TRH com andrógenos em mulheres é baseada na recuperação dos níveis fisiológicos do hormônio, utilizando-se baixas doses comparadas às usadas em homens; no entanto, o emprego destas doses nas mulheres é bastante impreciso e relativamente empírico (97, 98) já que existe dificuldade na medição das concentrações basais e as mesmas não refletem os níveis de andrógenos teciduais (3).
