Determinação de parâmetros funcionais in vitro

4.4.1. Preparação da musculatura lisa da bexiga e construção de curvas concentração- resposta

Os animais foram eutanasiados utilizando câmera de isoflurano na concentração de 5% para o aprofundamento do animal. A confirmação da morte foi determinada pela ausência de movimentos respiratórios e batimentos cardíacos, seguido de exsanguinação. Realizou-se uma incisão na altura do abdômen, a bexiga foi exposta, rapidamente isolada e colocada em solução nutritiva Krebs-Henseleit: 117 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3

e 11 C6H12O6, pH 7,4. O corpo da bexiga (detrusor) foi cortado em tiras longitudinais e montado

em banho de órgão isolado de 10 mL preenchido com solução Krebs e aerada continuamente com mistura carbogênica de O2/CO2 (95:5%). Um lado da tira muscular foi fixado no suporte

de silicone e a outra extremidade foi fixada no transdutor de força (ADInstruments, New South 8

4 12 16 20

Tempo de vida (semanas)

Biotério do Depto Farmacologia Água/comida ad libitum Claro/escuro 12/12h To_{: 22 - 24} o _C Peso: 250 – 270 g Ovariectomia bilateral (OVX)

Cetamina/xilazina (60:6 mg/kg; IP)

Protocolos experimentais

Tempo de ovariectomia (semanas)

24

0 4 8

0

16 12

Wales-Austrália) acoplado num sistema de aquisição de dados PowerLab 4/30 (ADInstruments, New South Wales–Austrália). A solução krebs foi trocada a cada 15 minutos, reajustando a tensão basal a 10 mN, até completar uma hora de estabilização.

Para avalição das respostas contráteis, realizou-se curvas concentração-resposta ao agonista muscarínico, carbacol (CCh: 100 pM – 100 µM), na presença e/ou ausência do veículo (álcool: 1 µL ou buffer fostato: 1 µL), testosterona (T: 100 nM), 5α-DHT (100 nM), testosterona 3-(O-carboximetil)oxima: BSA (T-BSA: 100 nM) e/ou flutamida (1 µM), incubados durante 1 h para animais controle e 30 minutos no caso de ratas ovariectomizadas. Após as curvas, foi acrescentada concentração única do agente despolarizante, cloreto de potássio (KCl, 80 mM). Ao término dos experimentos, os tecidos foram retirados e pesados.

Em experimentos separados, foram construídas curvas concentração-resposta ao CaCl2 (10 µM – 300 mM) na presença de testosterona (100 nM, 30 min) e/ ou veículo (álcool; 1 µL,

30 min). Antes do protocolo experimental, os tecidos foram lavados e mantidos em solução krebs sem Ca2+ _{junto com EGTA (1 mM), este usado para sequestrar íons cálcio. A depleção}

dos estoques de Ca2+ _{do citosol foi feita utilizando KCl (80 mM; concentração única) e carbacol}

(1 µM; concentração única). A depleção do estoque de Ca2+ _{do retículo sarcoplasmático foi}

feita mediante a incubação de ácido ciclopiazônico (CPA: 10 µM) (28). Em seguida, realizou- se as curvas cumulativas ao CaCl2. As respostas contráteis da musculatura lisa detrusora aos

agonistas foram apresentadas em mN, corrigidas pelo peso úmido dos tecidos (mN/mg).

Os gráficos foram analisados por meio do programa GraphPad Prism (GraphPad Software 5,0, Califórnia, EUA). Os valores de potência (pD2) e resposta máxima (Emax) foram

calculados pela seguinte equação: E= Emax/[(1+(10c/10x)N + Ф], onde E é elevação do tônus

basal, Emax é a máxima resposta agonista que pode produzir, “c” é o logaritmo de EC50,

contração do agonista que produz 50% da resposta máxima; “x” é o logaritmo da concentração do agonista; o exponente, “N”, significa a inclinação da curva concentração-resposta e Ф é a resposta observada na ausência do agonista. As análises de regressões não lineares para determinar os parâmetros Emax, pD2 e o “n” foram feitas utilizando-se o programa GraphPad

4.4.1.1. Estimulação elétrica de campo (Electrical-field Stimulation; EFS)

A EFS foi aplicada em tiras longitudinais de bexiga que foram montadas como descrito anteriormente. Colocou-se a bexiga entre dois eletrodos de platina conectados ao estimulador S88 (Grass Telefector; Warwick, EUA). Os experimentos foram feitos utilizando os seguintes parâmetros: 80 V, 1 ms de pulso e 10 s de duração entre as frequências 1–32 Hz, conforme experiência prévia do grupo (47, 48). Os intervalos de frequência foram de 2 minutos. As curvas frequência-respostas foram feitas na presença e/ou ausência de veículo (álcool: 1 µL ou buffer fostato: 1 µL), testosterona (T: 100 nM), 5α –DHT (100 nM), T-BSA (100 nM) e/ou flutamida (flu: 1 µM), incubados durante 1 h para animais controle e 30 minutos para ratas ovariectomizadas. As respostas contráteis da musculatura lisa detrusora decorrente da liberação de neurotransmissores foram apresentadas em mN, corrigida pelo peso úmido dos tecidos (mN/mg).

4.4.1.2. Análise da resposta relaxante da bexiga

A bexiga foi montada e estabilizada como descrito anteriormente. Foram feitas curvas concentração-resposta ao agonista seletivo β3-adrenérgico, mirabegron (100 pM – 100 µM) e

ao agonista β-adrenérgico não-seletivo, isoproterenol (100 pM – 100 µM), em tecidos pré- contraídos com carbacol (1 µM), na presença e/ou ausência de veículo (álcool: 1µL), testosterona (T: 100 nM) e 5α-DHT (100 nM) incubados durante 1 h para animais controle e 30 minutos para ratas ovariectomizadas. Adicionalmente, a fim de explorar a capacidade da testosterona de relaxar a bexiga, foram feitas curvas concentração-resposta a este hormônio (100 nM - 300 mM) em tecidos pré-contraídos com carbacol. As respostas relaxantes foram apresentadas como porcentagem referente à pré-contração do tecido (%).

4.4.2. Preparação da musculatura lisa uretral e construção de curvas concentração-resposta

Após eutanásia, a uretra foi exposta, removida e a porção proximal foi cortada em dois anéis que foram montados em sistema de miógrafo de 5 mL (DTM modelo 610M, Danish Myo technology Aarhus). O banho de órgão foi preenchido com solução krebs (composição acima), aerado continuamente com mistura carbogênica de O2:CO2 (95:5%) e trocado cada 15 minutos

até completar uma hora de estabilização. A tensão basal foi ajustada para 2 mN. Para avalição das respostas contráteis foram feitas curvas concentração-resposta à fenilefrina (FE: 1 nM- 300

µM) e CaCl2 (10 µM – 300 mM) na presença e/ou ausência de veículo (álcool; 0,5 µL),

testosterona (T: 100 nM), (5α-DHT: 100 nM), T-BSA (100 nM) e/ou flutamida (flu: 1 µM), incubados durante 1 h para animais controle e 30 minutos para ratas ovariectomizadas. Em experimentos separados, para avaliar farmacologicamente a presença de L-VOCC no tecido uretral foram feitas curvas concentração-resposta ao CaCl2 na presença de diferentes

concentrações de nifedipina (3, 30 e 300 nM). As respostas contráteis da musculatura lisa da uretra aos agonistas foram apresentadas em mN, corrigidas pelo peso úmido dos tecidos (mN/mg). Os gráficos foram feitos como acima descrito para a bexiga.

4.4.2.1. Análise da resposta relaxante da uretra

A uretra foi montada e estabilizada como acima descrito. Foram feitas curvas concentração-resposta ao SNP (1 nM – 100 µM) em tecidos pré-contraídos com KCl (40 mM), na presença e/ou ausência de veículo (álcool; 0,5 µL) e testosterona (T: 100 nM) incubados durante 1 h para animais controle e 30 minutos para ratas ovariectomizadas. Adicionalmente, com o intuito de investigar o efeito relaxante da testosterona na uretra, foram feitas curvas concentração-resposta ao hormônio (testosterona: 100 nM – 300 mM) em tecidos pré- contraídos com KCl 40 mM. As respostas relaxantes foram apresentadas como porcentagem referente à pré-contração do tecido (%).