A Torre do Tombo e a política arquivística nacional

nécrotrophes et dans le genre Alternaria

3.1.1. Pénétration des cellules de l’hôte

a) Adhésion à l’hôte

Les champignons pathogènes foliaires sont le plus souvent disséminés sous forme de spores par le vent ou la pluie. Les spores sont des structures capables de résister aux contraintes environnementales fortes rencontrées lors de leur dissémination et des premières étapes de la

colonisation de l’hôte. Elles peuvent, par exemple, contenir des pigments, tels que la mélanine, qui préviendront les effets délétères des rayonnements ultraviolets ou encore renforceront leurs parois.

L’adhésion rapide à la surface de l’hôte est également nécessaire pour éviter une nouvelle dispersion vers des conditions défavorables. Cette étape clef est présente chez de nombreuses espèces fongiques. A la surface des spores des champignons filamenteux se trouvent des protéines, les hydrophobines,

qui facilitent l’adhésion des spores de manière passive à la surface hydrophobe de la plante (Almeida

et Brand 2017). L’adhésion implique en outre, dans la plupart des cas, la mise en œuvre d’une matrice

extracellulaire pouvant être composée de glycoprotéines hydrophobes, de lipides ou de polysaccharides. Cette matrice extracellulaire peut également contenir des enzymes de dégradation

de la cuticule (cutinases) ou des parois végétales qui vont faciliter l’attachement à l’hôte mais aussi

les étapes de pénétration (Carver et Gurr 2008). Chez A. dauci, Cora Boedo et al. (2008) ont mis en

évidence la présence abondante de matrices extracellulaires, comme il avait été précédemment

montré chez d’autres espèces d’Alternaria, permettant la fixation à la surface des feuilles de carotte.

b) Détection de la plante et processus de pénétration

La pénétration dans les organes de l’hôte par les agents pathogènes peut se dérouler de manière passive au travers d’ouvertures préexistantes, ou active par la formation de structures

différenciées et par l’usage d’enzymes ou de forces mécaniques. Les processus d’invasion de la plante

sont initiés par sa détection par l’agent pathogène. La croissance, mais aussi la formation de

structures spécialisées pour l’invasion seraient induites par le thigmotropisme associé à un chimiotropisme. Le thigmotropisme est une orientation de la croissance et de la différenciation cellulaire par le « toucher » et la perception de la surface et de la topographie de la feuille (Almeida et Brand 2017).

Stratégies de pénétration de l’hôte

Certains champignons, tels que l’agent biotrophe Cladosporium fulvum, vont simplement

profiter d’ouvertures naturelles, telles que les stomates ou les blessures, pour pénétrer sous la cuticule

et pouvoir envahir la feuille (figure 8) (Cora Boedo et al. 2008; Doehlemann et al. 2017). Ces champignons produisent des hyphes exploratoires qui suivent les sillons formés par la topographie

des cellules épidermiques de la feuille et selon des profils liés à la disposition des stomates de l’hôte. La détection de la cavité que représente l’ostiole induit une différenciation en appressorium médiée par le thigmotropisme ou encore une croissance asymétrique conduisant à une pénétration directe (Almeida et Brand 2017).

De nombreuses autres espèces fongiques, telles que Magnaporthe oryzae ou

Colletotrichum spp., vont former des structures de pénétration nommées appressoria. Ces structures monocellulaires en forme de dôme sont caractérisées par une paroi cellulaire renforcée et une forte

mélanisation, sauf en un point qui correspond au départ de l’hyphe infectieuse (figure 8 ; Doehlemann

et al. 2017). C’est la perception, par l’agent pathogène, de la zone de contact entre le tube germinatif et la surface de la feuille qui permet la différentiation en appressorium et l’orientation de la structure

de pénétration qui en résulte (Almeida et Brand 2017). La cellule de l’extrémité du tube germinatif

va se différentier, sa paroi s’enrichir en chitine et de la mélanine se dépose en grande quantité contre la membrane plasmique. Au niveau du contact avec la plante, une zone de l’appressorium de laquelle

va sortir une hyphe infectieuse, ou pore ne présente ni mélanisation, ni renforcement de la paroi mais

un anneau de septine. Une réorganisation des filaments d’actine va se produire. Ils se lient à l’anneau de septine au niveau de la membrane plasmique du pore de l’appressorium provoquant une

déformation de la membrane et de la paroi fongique initiant l’hyphe infectieuse. Du glycérol va être

accumulé au sein de l’appressorium provoquant une forte pression osmotique (jusqu’à 8 MPa chez Magnaporthe oryzae). Cette pression permet à l’hyphe de percer la cuticule, puis la paroi des cellules

sous-jacentes et donc la pénétration de cette hyphe spécialisée dans l’épiderme de la plante

(Doehlemann et al. 2017).

D’autres structures différentiées ressemblant à des appressoria sont observées chez d’autres champignons tels que Botrytis cinerea ou A. dauci.Ces structures facilitent également la pénétration

et sont souvent trouvées dans la littérature sous l’appellation «appressoria-like ». Elles se distinguent

des appressoria par l’absence de mélanine et par la mise en œuvre de mécanismes d’action dont l’élément principal impliquerait plutôt la sécrétion d’enzymes lytiques, telles que les cutinases ou les

enzymes dégradant la paroi cellulaire végétale (Doehlemann et al. 2017).

D’après C. Boedo et al. (2010), un jour après le contact avec la plante, 100% des conidies

d’A. dauci vont germer et forment en général plusieurs tubes germinatifs. Ce nombre semble influencé par le génotype de carotte considéré et notamment son niveau de résistance partielle : plus un génotype est résistant, plus le nombre de tubes germinatifs est grand. Une des modalités de résistance

mise en œuvre doit changer la perception de la feuille par le champignon et induire un plus grand

nombre de points d’infection. A. dauci peut pénétrer soit directement par les stomates, ou encore grâce

à la formation de structures de type appressorium non mélanisées (Cora Boedo et al. 2008). Cora

Boedo et al. (2008) ont, de plus, observé la présence d’hyphes sous-cuticulaires, ce qui supposerait que

la pénétration d’A. dauci impliquerait des enzymes cutinolytiques.

Détection de la plante par l’agent pathogène et voies de signalisation impliquées

L’initiation de la pénétration que ce soit par la différentiation cellulaire ou par l’orientation de la croissance cellulaire passe d’abord par la reconnaissance du contact avec l’hôte. Plus cette

reconnaissance est fine, plus la spore à une chance de germer dans des conditions favorables à la

réalisation du cycle infectieux. Cette reconnaissance de l’hôte implique en général deux formes de

signaux, une perception de la surface (thigmotropisme) et une perception chimique (chimiotropisme).

Les mécanismes de cette reconnaissance ne sont à l’heure actuelle, connus que de manière parcellaire.

La signalisation cellulaire au sein de l’agent pathogène est, actuellement, mieux connue que la base

moléculaire de la détection des contacts entre l’agent pathogène et son hôte (Almeida et Brand 2017).

La cuticule est plutôt connue comme une barrière limitant l’infection par les champignons, mais son rôle dans l’interaction est plus complexe. En effet, la cuticule des plantes et sa composition

joueraient un rôle indirect mais clef dans cette reconnaissance. De manière générale, les agents

pathogènes produisent et sécrètent constitutivement de faibles quantités d’enzymes lytiques visant

la cuticule. La surface des spores de différents champignons tels que Blumeriagraminis,

Uromycesvicia-fabae, Alternariaalternata, Alternariabrassicicola, portent des lipases, des cutinases ou encore des estérases. Lors du contact avec la plante, les enzymes déjà présentes en surface dégradent les cires de la surface foliaire. Les produits de cette dégradation vont ensuite jouer un rôle de signal chimique spécifique en activant la germination, la différentiation des cellules fongiques ou

2017). Un exemple simple est le fait que les produits de dégradation de la cutine de l’hôte, issus de l’activité enzymatique des enzymes préexistantes, vont induire la production de cutinases en grande

quantité (Oka et al. 2005; Tang et al. 2017). Chez A. brassicicola, une lipase (sérine estérase) présente à la surface des spores avant leur germination, possède une activité cutinolytique. Cette activité

induirait des cutinases précoces et serait nécessaire à l’établissement de l’infection. Les lipases

induites précocement ou encore produites avant le contact sont indispensables à l'adhésion, mais également à la pénétration ultérieure de l’agent pathogène (Berto et al. 1999). Chez ce même

champignon, un mécanisme de reconnaissance d’une part du contact avec l’organe foliaire et d’autre

part de l’espèce de plante en présence, induirait à la fois la germination des spores et la production d’une toxine hôte spécifique nécessaire à son pouvoir pathogène, la toxine AB. En effet, les spores en

germination d’A. brassicicolane produisent la toxine AB qu’au contact des feuilles appartenant à des espèces hôtes (Brassicacées). Les cutinases et les lipases d’A. brassicicola conduiraient à la libération

d’un composé de dégradation de la cuticule, un oligosaccharide composé principalement de mannose et de galactose, spécifique de certains hôtes. Ce serait ce composé qui induirait principalement la production de toxine AB dans les spores en germination (Oka et al. 2005). Tang et al. (2017) ont montré

que les cires cuticulaires de Pyrus× bretschneideri Rehd et surtout les produits de leur dégradation

par l’action de cutinases, favorisent la formation, chez A. alternata, de tubes germinatifs courts et

différenciés, d'appressoria et d'hyphes d’infection. L’activité enzymatique des cutinases d’A. alternata

est également induite par les cires. Au-delà d’une détection chimique, c’est également une détection

liée à des propriétés physiques qui entre en jeu. Tang et al. (2017) ont montré que l’hydrophobicité

superficielle élevée résultant de la composition de la cuticule augmente également la formation des structures infectieuses. Ces résultats suggèrent que la composition chimique et l'hydrophobicité de la

cuticule foliaire du poirier régulent la croissance et la différenciation des spores d’A. alternata et sont indispensables à l’infection.

L’autre indice permettant à l’agent pathogène de détecter la surface de plante est la détection

physique de cette surface et de sa topographie (thigmotropisme). En effet, chez les champignons il est

couramment observé par microscopie que l’extrémité des hyphes exploratoires est en biseau orienté vers le substrat, et que leur croissance est orientée en fonction du relief (Almeida et Brand 2017).

Cependant même si ce phénomène semble d’une grande importance dans l’infection, la base

moléculaire de cette perception reste mal connue. Pourtant la signalisation de ce phénomène au sein

de la cellule fongique a été très étudiée. À l’heure actuelle, aucune protéine permettant la détection

mécanique du contact n’a été identifiée. Cependant il existe de nombreuses preuves de l’implication d’un influx de calcium au sein de la cellule fongique dans la signalisation du contact. Almeida et Brand (2017) ont répertorié les mécanismes possiblement mis en jeu dans cette perception mécanique. Ces auteurs se sont basés sur les mécanismes connus et bien étudiés chez

d’autres organismes, tels que les animaux et les levures Candida albicans et Saccharomyces cerevisiae. Peu de ces mécanismes ont été mis en évidence chez les champignons filamenteux.

Figure 9: Perception et voies de signalisation potentiellement impliquées dans le "mechanosensing" chez les champignons (figure 7, Almeida et Brand, 2017).

Almeida et Brand (2017) évoquent un total de cinq mécanismes de perception mécanique de

l’hôte : (i) les systèmes de détection de l'intégrité de la paroi cellulaire, (ii) les protéines de type intégrine, (iii) les canaux ioniques mécano-sensibles, (iv) les systèmes de détection du stress osmotique

et (v) les récepteurs couplés aux protéines G (figure 9). Parmi ces cinq mécanismes, seuls les trois

derniers semblent présents au sein de champignons filamenteux.

En ce qui concerne les canaux ioniques mécano-sensibles, seules des expériences de «

patch-clamp » réalisées sur Neurospora crassa laisseraient supposer leur existence chez des champignons filamenteux. Chez la levure, l’étude de la protéine Mid1(Mating-induced death 1) a montré qu’il s’agirait de canaux sélectifs pour le Ca²+, activés par l’étirement de la membrane. La mutation du gène

Mid1 entraîne un moindre flux entrant de Ca²+, l’arrêt des processus de reproduction et à terme la

mort cellulaire.

Des systèmes de détection du stress osmotique et de l’intégrité pariétale ont été mis en

évidence chez différents champignons. Chez Fusarium oxysporum, une glycoprotéine

transmembranaire fortement glycosylée, la « mucin-like » Msb2 est essentielle à la détection de la surface, à la virulence et à la croissance filamenteuse permettant la colonisation. Il a été montré que

Msb2 serait à l’origine de l’activation de différentes voies de signalisation. En effet, Msb2 se situerait

croissance et de la virulence. Il se situerait en outre en aval d’une voie impliquant la MAPK Hog1,

impliquée dans la réponse au stress pariétal et à la réponse à un stress hyper-osmotique (Pérez-Nadales et Pietro 2011; Almeida et Brand 2017).

Dans le cas de la signalisation par des récepteurs liés à la protéine G, une activation de la

sous-unité α des protéines G, conduit à l’accumulation de Ca2+et d’AMPc qui vont respectivement activer

la calmoduline et la protéine kinase A. Or chez M. grisea, le rôle dela protéine kinase A dans la

formation des appressoria a été mis en évidence. Un récepteur couplé à la protéine G, Pth1, a été

identifié chez M. grisea comme répondant au contact de surfaces hydrophobes en activant une voie de

signalisation aboutissant à la formation d’appressoria. Le mutant d’insertion dans Pth1produit 85%

de moins d’appressoria que le sauvage sur des surfaces hydrophobes. Or le phénotype est restauré par

l’ajout exogène d’AMPc, ce qui tend à confirmer la nature de cette voie de signalisation. La

transmission du signal passerait donc par la voie de la protéine kinase A qui pourrait jouer un rôle

clef dans la régulation du développement et de la maturation des appressoria de M. grisea (Almeida

et Brand 2017).

Les résultats de nombreuses études, notamment chez M. oryzae, ont permis de découvrir les

voies de signalisations conduisant à la croissance orientée et à la différentiation de structures. En effet

chez M. oryzae, il a été montré que le tube germinatif, au contact de la plante, réalise un cycle de

mitose au cours duquel va s’enclencher la différenciation de la cellule apicale en appressorium.

Saunders, Aves, et Talbot (2010) ont étudié des mutants conditionnels altérés dans différents stades

du cycle cellulaire. Ces travaux ont montré que la perception de l’hôte est nécessaire à un passage

rapide de la phase G1 à la phase S, suivi de l’initiation de la formation d’appressoria. Le mutant du

gène Never in Mitosis 1 chez M. oryzae, affecté dans la réplication de l’ADN, a permis de déterminer

que l’entrée en phase S du cycle cellulaire régissait l'initiation et la différenciation de la structure infectieuse. D’après Saunders, Aves, et Talbot (2010), l'initiation de la différentiation en appressorium

dépend de la réplication de l'ADN et la poursuite du cycle jusqu’à la mitose est à la fois nécessaire et

suffisante pour initier la maturation de l'appressorium chez M. oryzae.

Plus récemment Osés-Ruiz et al. (2017) ont cherché à identifier les points de contrôle présents

dans la phase S et permettant cette initiation. Ils ont mis en évidence que cette régulation se déroule sur deux cycles cellulaires. Durant une première phase S, la voie de réponses aux dommages de l'ADN,

via la kinase Cds1, va permettre l’activation de la différentiation de la cellule apicale en appressorium. Cependant l’étude des mutants Cds1 a montré qu’il n’y avait pas restauration de l’infection en présence d’inhibiteurs de la réplication de l'ADN, lesquels empêchent la formation de structures d’infection fonctionnelles. Cela remettrait en cause l’importance de cette régulation. Durant un second

cycle cellulaire lorsque l’accumulation de mélanine et d’osmolytes atteint un premier seuil, le remodelage du cytosquelette d'actine en lien avec l’anneau de septine a lieu permettant la formation du pore de l’appressorium et la formation de l’hyphe pénétrant l’épiderme de la plante.

À l’heure actuelle les mécanismes de perception de l’hôte par A. dauci n’ont, à notre

connaissance, pas encore été étudiés.

c) Dégradation de la paroi végétale

Une des protections de la plante contre les agressions est la paroi cellulaire. Elle est

principalement formée de cellulose, d’hémicellulose et de pectine. Les champignons pathogènes ont à

leur disposition un arsenal enzymatique permettant la dégradation de ces structures.

Alternaria brassicicola, par exemple, possède de nombreux gènes codants pour des glycosides hydrolases, telles que des cellobiohydrolases ou des glucanases (171 gènes), ou encore des pectates lyases (18 gènes) (Srivastava et al. 2012). Ces enzymes sont sécrétées par les agents nécrotrophes lors de la pénétration et la colonisation de la plante. Elles revêtent un rôle majeur dans la pénétration de

la plante, la mort cellulaire, la libération d’éliciteurs mais aussi dans l’extraction des éléments

nutritifs lors de ces événements (ten Have et al. 2002). Au regard de la complexité de composition de

la paroi végétale, une grande variété d’enzymes lytiques sont produites par les champignons et sont

codées par de nombreuses familles de gènes différant par leurs structures. Dans le mélange enzymatique produit par un organisme nécrotrophe, de nombreuses enzymes sont redondantes

fonctionnellement. Il est alors difficile d’étudier leur rôle individuel dans le pouvoir pathogène (Isshiki

et al. 2001). Les activités synergiques de ces enzymes, que ce soit par leur activité séquentielle, par leur expression co-régulée ou par un effet de type quantitatif additif, sont, quant-à-elles, impliquées dans le pouvoir pathogène de champignons nécrotrophes dans le cadre de nombreuses interactions hôte-agent pathogène (ten Have et al. 2002). De nombreuses évidences de la co-régulation de

l’expression de gènes codants pour des enzymes de dégradation de la paroi végétale et de divers gènes

impliqués dans le pouvoir pathogène existent. Par exemple, chez A. brassicicola, AbPf2 et AbVf19

codent pour des facteurs de transcription régulant respectivement l’expression de 106 et 74 gènes et vont induire une forte réduction de l’agressivité. Parmi les gènes régulés par ces facteurs de transcription se trouvent de nombreux gènes codants pour des enzymes de dégradation de la paroi

végétale (Cho et al. 2015; Srivastava et al. 2012). Une base de données consultable, mycoCLAP, a

répertorié les gènes et les caractéristiques biochimiques de 737 enzymes différentes, telles que des glycoside hydrolases, des estérases glucidiques, des polysaccharide lyases ou encore des oxydoréductases, réparties en 115 familles et issues de 226 espèces fongiques, appartenant

majoritairement au groupe des Ascomycètes (Strasser et al. 2015; Murphy et al. 2011). Les enzymes

de dégradation de la paroi végétale peuvent être séparées en fonction de leur substrat en trois groupes principaux selon les trois composés majoritaires de la paroi végétale (cellulose, hémicellulose, pectine).

Enzymes de dégradation de la cellulose

La cellulose est le composé principal de la paroi cellulaire végétale. Il s’agit d’un

par des cellulases. Kubicek, Starr, et Glass (2014) rapportent que les cellulases mises en évidence dans les génomes de plus de 40 espèces parmi les Ascomycètes et les Basidiomycètes ne se répartissent que dans un petit nombre de familles (9). Elles peuvent posséder des activités cellobiohydrolases

(exoglucanases), endo-β-1,4-glucanases ou β-glucosidases. Ces trois activités sont nécessaires à une

dégradation complète de la cellulose. En effet, les cellobiohydrolases catalysent le clivage des extrémités de la molécule, les endo-β-1,4-glucanases clivent, quant à elles, les liaisons β-(1, 4) internes à la molécule de cellulose permettant une diminution du degré de polymérisation. Ces deux réactions aboutissent à la dégradation de la cellulose en cellobiose, puis les β-glucosidases vont cliver ces dimères en monomères de glucose (figure 10). La dégradation de la cellulose par les cellulases est

augmentée de manière synergique par l’action de protéines fongiques dont la production est co-régulée avec celle des cellulases. Ces protéines ont la particularité de ne pas présenter d’activité cellulolytique

propre, mais d’induire une plus forte activité des cellulases. Trichoderma reesei, par exemple, produit

l’une de ces protéines, nommée swollénine, dont la structure est proche de celle des cellulases

(Kubicek, Starr, et Glass 2014). Chez les champignons du genre Alternaria, l’importance des cellulases

dans le pouvoir pathogène a été mise en évidence dans plusieurs couples hôte-agent pathogène. Par

exemple, A. alternata, causant la moisissure des pépins de pomme de la variété Red Delicious, produit

une endo‐ β-1,4-glucanase (Reuveni et al. 2007). Or Reuveni et al.(2007) ont mis en évidence une

corrélation entre, d’une part, la production de cette endo‐β-1,4-glucanase, et d’autre part, la virulence

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