Al´ em do sinergismo cl´ assico

Al´em do sinergismo exibido pelas celulases, nos ´ultimos anos come¸caram a ser descobertas prote´ınas com atividades auxiliares, que potencializam a a¸c˜ao das ce- lulases. Estas prote´ınas pertencem a duas categorias: enzimas com atividades auxiliares (AA) e prote´ınas disruptivas n˜ao-hidrol´ıticas.

Prote´ınas disruptivas n˜ao-hidrol´ıticas

As prote´ınas disruptivas n˜ao-hidrol´ıticas potencializam a atividade de celulases por supostamente causarem a amorfiza¸c˜ao da estrutura da celulose e afrouxamento da arquitetura da parede celular, aumentando a acessibilidade do substrato `as enzimas [71–73]. Quando misturadas com celulases, causam um aumento da libera¸c˜ao de a¸c´ucares sol´uveis. Na ausˆencia de celulases, por´em, n˜ao d˜ao ind´ıcios de atividade

2.3. Hidr´olise enzim´atica 23

Figura 2.9. Sinergismo cl´assico entre endoglucanases (EG), celobiohidro- lases (CBH I e CBH II) e β-glicosidades (BG). Os c´ırculos vazios representam res´ıduos de glicose na estrutura da celulose, e os c´ırculos cheios representam extre- midades redutoras. Adaptado de [68] com permiss˜ao da Elsevier.

hidrol´ıtica. Prote´ınas dessa classe ocorrem em plantas, bact´erias e fungos, e s˜ao conhecidas por nomes como expansinas, suoleninas e looseninas [74–77].

de prote´ınas disruptivas pode se manifestar em diferentes escalas, incluindo dis- pers˜ao de fibras de celulose adjacentes, enfraquecimento de paredes celulares e descristaliza¸c˜ao de cadeias de celulose [78]. Entretanto, o mecanismo de atua¸c˜ao preciso destas prote´ınas ´e desconhecido.

Enzimas com atividades auxiliares (AA)

As enzimas com atividades auxiliares (AAs) s˜ao monooxigenases de clivagem de po- lissacar´ıdeos (LPMO: lytic polysaccharide monooxygenase) que empregam c´ations Cu(II) para clivar liga¸c˜oes glicos´ıdicas atrav´es de um mecanismo oxidativo. Prote´ı- nas dessa classe foram inicialmente classificadas, no banco de dados CAZy, como m´odulos de liga¸c˜ao ao carboidrato da fam´ılia 33 (CBM33) e membros da fam´ılia GH61 de glicos´ıdeo hidrolases [79]. Com a descoberta de seus mecanismos oxidati- vos, que introduziu um novo paradigma de degrada¸c˜ao de celulose, estas enzimas foram reclassificadas nas novas classes de AAs [80]. As AAs clivam liga¸c˜oes gli- cos´ıdicas na superf´ıcie da celulose, sem a necessidade de descristalizar cadeias indi- viduais de glucano [79, 81]. Assim, introduzem extremidades em cadeias de glucano em pontos aleat´orios da superf´ıcie da celulose e, como consequˆencia, potencializam a a¸c˜ao das celulases [82]. Diferentemente das prote´ınas disruptivas n˜ao-hidrol´ıticas, o entendimento mecan´ıstico das AAs tem avan¸cado rapidamente nos ´ultimos anos [81, 83–85], o que certamente ´e devido `a natureza bioqu´ımica de seus efeitos na biomassa – ao contr´ario dos efeitos biof´ısicos das prote´ınas disruptivas.

Parte II

Metodologias computacionais

Cap´ıtulo 3

Dinˆamica molecular de

biomol´eculas

A dinˆamica das biomol´eculas est´a intimamente ligada a suas fun¸c˜oes e, portanto, deve ser caracterizada para o entedimento de processos moleculares. No caso de prote´ınas, o estado nativo, apto a exercer alguma fun¸c˜ao biomolecular, ´e caracteri- zado por um ensemble de conforma¸c˜oes que, embora sejam globalmente similares, diferem em detalhes, tais como conforma¸c˜oes de cadeias laterais e de loops, ou de posi¸c˜oes relativas de diferentes dom´ınios. Estes estados conformacionais existem num equil´ıbrio dinˆamico, o que est´a diretamente ligado aos movimentos funcionais da prote´ına.

Simula¸c˜oes de dinˆamica molecular constituem uma metodologia computacional utilizada para estudar o movimento de part´ıculas de um sistema atˆomico-molecular qualquer [86, 87] e, em particular, de biomol´eculas em solu¸c˜ao [88, 89], possibili- tando a visualiza¸c˜ao das transi¸c˜oes naturais entre suas v´arias conforma¸c˜oes ter- micamente acess´ıveis [90]. Desde a publica¸c˜ao da primeira simula¸c˜ao de dinˆamica molecular de prote´ına, em 1977 [91], o progressivo desenvolvimento de algoritmos, softwares e hardwares tem permitido a consolida¸c˜ao da dinˆamica molecular como uma t´ecnica precisa e acess´ıvel para caracteriza¸c˜ao dinˆamica de biomol´eculas [92]. Frequentemente, as simula¸c˜oes de dinˆamica molecular n˜ao somente reproduzem medidas experimentais, mas, por conta da alta resolu¸c˜ao espa¸co-temporal, permi- tem a visualiza¸c˜ao de mecanismos e a formula¸c˜ao de novas hip´oteses acerca de determinados processos biomoleculares. Hoje em dia, ´e cada vez mais comum si- mula¸c˜oes na escala de tempo de v´arios microssegundos e de at´e milissegundos, que ´e

a escala de tempo real de v´arios eventos moleculares [92]. Devido a desenvolvimen- tos de m´etodos multiescala que permitem o acomplamento de dinˆamica molecular cl´assica e quˆantica (QM/MM), hoje ´e poss´ıvel estudar rea¸c˜oes qu´ımicas em am- bientes complexos, como no interior de enzimas [93, 94]. Tais desenvolvimentos renderam a Martin Karplus, Michael Levitt e Arieh Warshel o Prˆemio Nobel de Qu´ımica de 2013.

Na dinˆamica molecular cl´assica, em que os el´etrons n˜ao s˜ao levados em conta explicitamente [95], a evolu¸c˜ao temporal das posi¸c˜oes de cada ´atomo do sistema ´e obtida atrav´es das leis da mecˆanica newtoniana. Cada ´atomo se move sob for¸cas de intera¸c˜ao exercidas por todos os outros ´atomos do sistema. A magnitude des- sas for¸cas depende dos detalhes qu´ımicos do meio. Ap´os a simula¸c˜ao por um determinado tempo, tem-se acesso `as posi¸c˜oes (x, y, z) e velocidades (vx, vy, vz)

de cada um dos ´atomos em resolu¸c˜ao de femtossegundos. Estes dados permitem, por exemplo, a visualiza¸c˜ao da dinˆamica estrutural de uma prote´ına e o c´alculo de propriedades estruturais, como flutua¸c˜oes m´edias ou a varia¸c˜ao temporal da estrutura secund´aria. Al´em disso, atrav´es da mecˆanica estat´ıstica [96], as proprie- dades termodinˆamicas do sistema podem ser obtidas, como a temperatura T , que ´

e uma fun¸c˜ao das velocidades quadr´aticas m´edias hv2

ii dos ´atomos (teorema de

equiparti¸c˜ao de energia): T = 1 3N kB 3N X i mihvi2i, (3.1)

e a press˜ao p, que ´e fun¸c˜ao tanto das coordenadas quanto das velocidades/temperatura (teorema do virial): pV = N kBT + 1 3 X i<j hrij · fiji. (3.2)

Nestas equa¸c˜oes, kB´e a constante de Boltzmann, N ´e o n´umero total de part´ıculas,

V ´e o volume do sistema, mi ´e a massa do ´atomo i, rij ´e o vetor que vai da part´ıcula

i at´e a part´ıcula j e fij ´e a for¸ca que a part´ıcula j exerce sobre a part´ıcula i. Pode-

se ainda obter propriedades mais espec´ıficas, tais como varia¸c˜oes de energia livre associadas a determinados processos, como a complexa¸c˜ao de um ligante a seu receptor ou efeitos de muta¸c˜oes locais na afinidade ligante-receptor [88, 97].

3.1. Algoritmos 29