Termofilicidade

A an´alise das flutua¸c˜oes estruturais locais das laminarinases mostrou que a acessibi- lidade do s´ıtio ativo ao substrato pode mudar ao longo do tempo. Estas altera¸c˜oes estruturais s˜ao devido a flutua¸c˜oes de um conjunto de cadeias laterais de res´ıduos do canal de liga¸c˜ao. Trˆes estados conformacionais majorit´arios foram observados e classificados conforme o grau de acessibilidade ao substrato: (i) estado obstru´ıdo ou fechado, em que res´ıduos do s´ıtio de liga¸c˜ao impedem o acesso do substrato ao s´ıtio ativo; (ii) estado aberto, em que o canal de liga¸c˜ao est´a completamente ex- posto ao solvente e ao substrato; e (iii) estado na forma de t´unel, em que res´ıduos do canal de liga¸c˜ao criam uma estrutura parcialmente fechada, mas que n˜ao im- pede a acessibilidade do substrato. A figura 6.3a ilustra cada um destes estados e a frequˆencia com que eles ocorrem nas simula¸c˜oes. O procedimento para a obten¸c˜ao destas frequˆencias est´a descrito em detalhes na se¸c˜ao seguinte.

As simula¸c˜oes mostram que, embora todos estes trˆes estados sejam acess´ıveis pelas laminarinases PcLam, aNLam e RmLam, a popula¸c˜ao predominante de cada um dos estados depende da enzima. Mais importante, a resposta das popula¸c˜oes predominantes com o aumento de temperatura reflete o comportamento meso-, termo- ou hipertermof´ılico das laminarinases. A 25 ◦C, a popula¸c˜ao dos trˆes esta- dos ´e similar para as laminarinases PcLam e aNLam, em que o estado conforma- cional predominante ´e o aberto. Por outro lado, a 90 ◦C, enquanto a popula¸c˜ao relativa dos trˆes estados permanece essencialmente inalterada para a termof´ılica aNLam, o estado obstru´ıdo se torna dominante para a mesof´ılica PcLam. Em termos de atividade enzim´atica, o estado aberto, por ser acess´ıvel ao substrato, ´e

Figura 6.3. Estados do s´ıtio de liga¸c˜ao das laminarinases e suas frequˆencias. O estado obstru´ıdo possui res´ıduos colapsados ao longo do canal de liga¸c˜ao das laminarinases e, por isso, possui o s´ıtio ativo inacess´ıvel ao substrato, sendo, portanto, inativo. O estado aberto, visto nas estruturas cristalogr´aficas, pos- sui o canal de liga¸c˜ao ao substrato completamente exposto, sendo uma forma ativa das enzimas. O estado t´unel ´e acess´ıvel ao substrato e possui res´ıduos formando uma poss´ıvel regi˜ao de confinamento para o substrato. Enquanto a popula¸c˜ao dos estados da mesof´ılica PcLam ´e sens´ıvel ao aumento de temperatura, a popula¸c˜ao das (hiper)termof´ılicas aNLam e RmLam ´e insens´ıvel. As popula¸c˜oes predominan- tes em cada temperatura reflete a atividade relativa de cada uma das enzimas, conforme descrito no texto.

uma forma ativa da enzima, enquanto que o estado obstru´ıdo, por possuir o s´ıtio ativo inacess´ıvel, ´e uma forma inativa. Consistentemente, os resultados mostram que a mesof´ılica PcLam se encontra em estados predominantemente ativos somente na temperatura de 25 ◦C; em 90 ◦C a PcLam passa a visitar predominantemente os estados inativos (obstru´ıdos), perdendo sua atividade enzim´atica. Por ser ter- mof´ılica, a aNLam resiste ao aumento de temperatura e permanece em estados predominantemente ativos em ambas as temperaturas. As simula¸c˜oes mostram,

6.3. Resultados e discuss˜ao 105 portanto, a raz˜ao molecular da perda e reten¸c˜ao de atividade enzim´atica em altas temperaturas da PcLam e aNLam, respectivamente.

Semelhantemente `a aNLam, a popula¸c˜ao dos estados do s´ıtio de liga¸c˜ao da Rm- Lam ´e insens´ıvel ao aumento de temperatura. No entanto, o estado predominante da RmLam ´e o da forma de t´unel, e n˜ao o aberto. Como o estado aberto, o t´unel n˜ao impede o acesso do substrato ao s´ıtio ativo, sendo, portanto, provavelmente ativo, consistente com a atividade enzim´atica da RmLam em altas temperaturas. Adici- onalmente, o t´unel cria um espa¸co nanoscopicamente confinado, que poderia: (i) reduzir a taxa de dissocia¸c˜ao do substrato antes da ocorrˆencia da rea¸c˜ao qu´ımica; e (ii) estabilizar o estado de transi¸c˜ao por meio de intera¸c˜oes enzima-substrato mais efetivas que no caso da conforma¸c˜ao completamente aberta. Assim, o estado t´unel pode ser o mais ativo, e o fato de ser o estado predominante em altas tempera- turas reflete a hipertermofilicidade da RmLam. Medidas de atividade enzim´atica da aNLam e RmLam com os mesmos substratos s˜ao necess´arias para corroborar a ideia de que o estado t´unel ´e mais ativo que o estado aberto.

O fato das laminarinases RmLam e aNLam exibirem predominˆancia de estados ativos tanto em 25 ◦C quanto em 90 ◦C sugere que estas enzimas n˜ao s˜ao com- pletamente inativas em temperaturas muito abaixo de suas temperaturas ´otimas. Embora enzimas termof´ılicas tendam a exibir baixa atividade em temperaturas pr´oximas `a ambiente, isto n˜ao constitui uma regra; h´a casos em que enzimas exi- bem atividade numa ampla faixa de temperatura [217]. Segundo as simula¸c˜oes, este pode ser o caso das laminarinases aNLam e RmLam. Para outras glicos´ıdeo hidrolases termof´ılicas, simula¸c˜oes mostraram que a exposi¸c˜ao do s´ıtio ativo s´o ocorre em altas temperaturas [238–240], indicando que simula¸c˜oes computacionais s˜ao capazes de indicar estados com baixa acessibilidade ao substrato em baixas temperaturas, se esse for o caso. No caso das laminarinases (hiper)termof´ılicas, estados acess´ıveis ao substrato predominam tamb´em em temperatura ambiente. De fato, h´a experimentos que mostram que a RmLam exibe atividade em 37 ◦C [241] e que a aNLam exibe atividade em 30 ◦C [230], muito embora n˜ao haja na literatura curvas de atividade enzim´atica em fun¸c˜ao da temperatura. Sendo assim, n˜ao h´a dados para dizer o qu˜ao mais baixo da atividade m´axima ´e a atividade

pr´oximo `a temperatura ambiente destas enzimas. Experimentos s˜ao necess´arios para corroborar os resultados das simula¸c˜oes.