Resultados

Estruturas cristalogr´aficas das celobiohidrolases ThCel7A e TrCel7A A compara¸c˜ao das estruturas cristalogr´aficas das celobiohidrolases ThCel7A e Tr- Cel7A mostra que a alta identidade sequencial destas enzimas se reflete em ca- racter´ısticas estruturais muito parecidas, como mostra a figura 5.7. Exceto por algumas pequenas diferen¸cas estruturais nos loops 5 e 7 e a dele¸c˜ao do loop 3, as estruturas s˜ao idˆenticas. Nos loops que formam o s´ıtio de liga¸c˜ao, no entanto, h´a algumas altera¸c˜oes locais causadas pelas cadeias laterais de res´ıduos. O res´ıduo Tyr371(r) – res´ıduos da TrCel7A ser˜ao identificados por (r) e da ThCel7A por (h) – localizado no loop 6 corresponde ao res´ıduo Ala384(h). Esta altera¸c˜ao suposta- mente afeta as intera¸c˜oes entre o loop 5 e 6 atrav´es dos res´ıduos correspondentes Tyr247(r) e Tyr260(h). Na TrCel7A, os res´ıduos Tyr247(r) e Tyr371(r) parecem ser respons´aveis por manter os loops 5 e 6 em contato. No caso da ThCel7A, a presen¸ca da Ala384(h) no lugar da Tyr371(r) enfraquece as intera¸c˜oes entre os loops e pode- ria conferir maior liberdade para o res´ıduo Tyr260(h). Embora as estruturas crista- logr´aficas revelem que a troca da Tyr371(r) pela Ala384(h) causa apenas um ligeiro descamento do loop 5 na ThCel7A, o fato das intera¸c˜oes Ala384(h)-Tyr260(h) se- rem mais fracas que as intera¸c˜oes correspondentes Tyr371(r)-Tyr247(r) e, al´em disso, o res´ıduo Ala384(h) ser menos volumoso que a Tyr371(r), sugere que as flu- tua¸c˜oes estruturais dos loops 5 e 6 poderiam ser maiores na ThCel7A, resultando num t´unel catal´ıtico mais flex´ıvel e com maior acesso ao substrato comparado ao t´unel da TrCel7A. Para estudar estas flutua¸c˜oes, simula¸c˜oes de dinˆamica molecular foram executadas para a ThCel7A e TrCel7A.

Flutua¸c˜oes estruturais locais do t´unel catal´ıtico

As simula¸c˜oes mostraram que o fato da Ala384(h) substituir a Tyr371(r) leva a altera¸c˜oes dinˆamicas na regi˜ao dos loop 5 e 6. O res´ıduo Tyr260(h) pode sofrer v´arias mudan¸cas conformacionais ao longo do tempo e modular o grau de ex- posi¸c˜ao do t´unel catal´ıtico da ThCel7A. A figura 5.8a mostra a evolu¸c˜ao temporal do rmsd (raiz quadrada do deslocamento m´edio quadr´atico) dos res´ıduos Tyr260(h)

5.2. A Celobiohidrolase Cel7A de Trichoderma harzianum 71

Figura 5.7. Estruturas cristalogr´aficas da TrCel7A e ThCel7A superpos- tas. Entre as poucas diferen¸cas entre as enzimas, observa-se a troca do res´ıduo Tyr371 (TrCel7A) pelo res´ıduo Ala384 (ThCel7A).

e Tyr247(r) do loop 5, em rela¸c˜ao `as suas estruturas m´edias. Os valores de rmsd foram utilizados para discriminar dois estados: estado 1, com rmsd menor que 3,0 ˚A, e estado 2, com rmsd maior 3,0 ˚A. A figura 5.8b mostra configura¸c˜oes repre- sentativas dos estados 1 e 2 na regi˜ao dos loops 5 e 6. Os resultados mostram que a cadeia lateral do res´ıduo Tyr260(h) ´e substancialmente mais m´ovel que o corres- pondente Tyr247(r). Al´em disso, as intera¸c˜oes da Tyr260(h) com a Ala384(h) s˜ao regularmente rompidas, fazendo com que a Tyr260(h) frequentemente transite do estado 1 para o 2. Quando isso acontece, o t´unel catal´ıtico da ThCel7A se torna exposto (estado 2). Por outro lado, as cadeias laterais dos res´ıduos Tyr247(r) e Tyr371(r) permanecem sempre em contato e n˜ao se observa a abertura dos loops 5 e 6 na TrCel7A. Ainda que o res´ıduo Tyr247(r) possa sofrer mudan¸cas conforma- cionais e ter acesso ao estado 2, suas flutua¸c˜oes n˜ao s˜ao suficientes para romper o contato entre os loops 5 e 6, o que impede o t´unel catal´ıtico da TrCel7A de ficar completemente exposto ao solvente. Assim, as simula¸c˜oes mostram que os res´ıduos Tyr260(h) e Tyr247(r) do loop 6 permanecem num equil´ıbrio conformacional, cujas consequˆencias estruturais s˜ao dependentes dos res´ıduos Ala384(h) e Tyr371(r), os quais determinam a facilidade com que os loops 5 e 6 se abrem.

Figura 5.8. (a) Evolu¸c˜ao temporal do rmsd dos res´ıduos Tyr247(h) (Th- Cel7A, em verde) e Tyr260(r) (TrCel7A, em azul) em rela¸c˜ao `as suas estruturas m´edias. O res´ıduo Tyr260(h) ´e mais m´ovel que o Tyr247(r), e ambos tˆem acesso a valores de rmsd correspondentes a dois estados (1 e 2). (b) Configura¸c˜oes repre- sentativas dos estados 1 e 2, na regi˜ao entre os loops 5 e 6. Devido `a presen¸ca da Ala384(h), o res´ıduo Tyr260(h) ´e m´ovel e pode abrir a regi˜ao entre os loops 5 e 6 na ThCel7A. O res´ıduo Tyr247(r), por outro lado, ´e menos m´ovel e volumoso, o que dificulta a abertura dos loops na TrCel7A.

Flutua¸c˜oes globais

A decomposi¸c˜ao das trajet´orias das celobiohidrolases ThCel7A e TrCel7A em com- ponentes principais (PCA) revela que a ThCel7A apresenta uma maior flexibilidade global que a TrCel7A. A figura 5.9a mostra as flutua¸c˜oes m´edias quadr´aticas (msd) ao longo dos 20 primeiros autovetores de maiores amplitudes. Observa-se que as diferen¸cas nas flutua¸c˜oes dos carbonos α da ThCel7A e TrCel7A s˜ao capturadas

5.2. A Celobiohidrolase Cel7A de Trichoderma harzianum 73 pelos dois primeiros componentes principais, indicando que movimentos de mais alta amplitude dos loops, que possivelmente est˜ao associados `a fun¸c˜ao regulat´oria destas enzimas, s˜ao diferentes.

Figura 5.9. (a) Flutua¸c˜oes quadr´atica m´edias (msd) dos carbonos α da ThCel7A e TrCel7A ao longo dos 20 primeiros modos de movimento extra´ıdos da an´alise de componentes principais. Observa-se que a ThCel7A exibe maio- res flutua¸c˜oes que a TrCel7A nos dois primeiros modos. (b) Soma cumulativa e normalizada das flutua¸c˜oes ao longo dos 20 primeiros modos, que capturam apro- ximadamente 60% de todo o movimento das enzimas.

A an´alise das flutua¸c˜oes m´edias por res´ıduo (figura 5.10) mostra a origem das diferen¸cas de mobilidade. As folhas β, que constituem o core estrutural das enzi- mas, s˜ao r´ıgidas, apresentando somente flutua¸c˜oes locais. A mobilidade do carbono α dos res´ıduos Tyr260(h) e Tyr247(r) do loop 5, bem como dos res´ıduos Ala384(h) e Tyr371(r) do loop 6, diferem por um valor menor que 0,5 ˚A. Isso significa que os efeitos relatados na se¸c˜ao anterior s˜ao devidos `as flutua¸c˜oes das cadeias laterais destes res´ıduos, e n˜ao a flutua¸c˜oes da estrutura terci´aria das enzimas. Estas, por sua vez, ocorrem no loop 4 e no loop 7. Enquanto o loop 4 ´e mais m´ovel, o loop 7 ´e menos m´ovel na ThCel7A que na TrCel7A. O loop 4 cobre o t´unel catal´ıtico e, por isso, sua flexibilidade pode favorecer a forma¸c˜ao do complexo enzima-substrato. O loop 7, por outro lado, por estar localizado na sa´ıda do t´unel catal´ıtico, pr´oximo ao s´ıtio de liga¸c˜ao do produto, poderia estar associado `as diferentes constantes de inibi¸c˜ao apresentadas pelas duas enzimas.

A figura 5.11 mostra a matriz de correla¸c˜oes cruzadas para a ThCel7A e TrCel7A computadas a partir da trajet´oria essencial destes sistemas. A trajet´oria

Figura 5.10. Flutua¸c˜oes m´edias dos carbonos α (rmsf) da ThCel7A e da TrCel7A. O painel superior mostra o rmsf para cada um dos res´ıduos e o painel inferior mostra estruturas superpostas obtidas das simula¸c˜oes e coloridas conforme a mobilidade de cada res´ıduo (ver escala de cores de rmsf na figura).

essencial foi obtida pela proje¸c˜ao das trajet´orias concatenadas de cada sistema no subespa¸co formado pelos 20 primeiros autovetores da an´alise de PCA. A figura 5.9b mostra a soma cumulativa e normalizada das flutua¸c˜oes quadr´aticas ao longo desses 20 autovetores. Aproximadamente 60% do movimento ´e capturado nesse su- bespa¸co de dimens˜ao 20. Os outros 40% do movimento est˜ao distribu´ıdos no espa¸co gerado por todos os outros autovetores, de dimens˜ao em torno de 1200. Assim, os 40% do movimento est˜ao dilu´ıdos em modos de baixa amplitude. Observa-se que as enzimas exibem v´arias regi˜oes correlacionadas; muitas delas, entretanto, envol- vem res´ıduos das folhas β, que naturalmente s˜ao correlacionados por participarem da rede de liga¸c˜oes de hidrogˆenio que forma as estruturas secund´arias das enzimas. Por outro lado, h´a correla¸c˜oes entre regi˜oes funcionalmente importantes das enzi- mas. Pares de loops localizados em lados opostos do t´unel catal´ıtico – loops 4/6, 4/7, 5/6 e 5/7 – exibem correla¸c˜oes. O fato dessas correla¸c˜oes aparecerem tanto para a ThCel7A quanto para a TrCel7A sugere que estes movimentos dependem

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Figura 5.11. Matriz de correla¸c˜oes cruzadas para ThCel7A e TrCel7A. Para ambas as enzimas, observa-se movimentos correlacionados entre os pares de loops 4/6, 5/6, 4/7 e 5/7. De azul a vermelho, as cores representam correla¸c˜oes negativas e positivas, respectivamente.

mais da estrutura terci´aria das enzimas que dos detalhes da estrutura prim´aria, de forma que tais movimentos devem estar relacionados `a fun¸c˜ao intr´ınseca das celobiohidrolases. Al´em disso, o fato do loop 7 – localizado pr´oximo ao s´ıtio do produto – se correlacionar com loops localizados sobre o s´ıtio ativo, indica uma poss´ıvel conex˜ao entre inibi¸c˜ao por produto e atividade enzim´atica.