Estrutura e fun¸c˜ ao

A TrCel7A ´e uma prote´ına bimodular, possuindo dois dom´ınios conectados por um longo linker flex´ıvel e glicosilado (figura 5.1). O dom´ınio N-terminal, denominado dom´ınio catal´ıtico (CCD: catalytic core domain), ´e composto por aproximadamente 430 res´ıduos e ´e onde ocorre a hidr´olise do substrato. O dom´ınio C-terminal, o m´odulo de liga¸c˜ao ao carboidrato (CBM: carbohydrate binding module), ´e uma

pequena por¸c˜ao da enzima respons´avel pela liga¸c˜ao da prote´ına `a superf´ıcie da celulose [129]. Embora essa seja a estrutura da maioria das CBHs, a estrutura de uma CBH que possui apenas o CCD foi reportada recentemente [130].

Figura 5.1. Modelo tridimensional da estrutura da TrCel7A, mostrando o CCD, o CBM e o linker glicosilado sobre a superf´ıcie da celulose, com uma cadeia de glucano ligada ao CCD para ser hidrolisada. Adaptado de [131].

Dom´ınio catal´ıtico (CCD)

A primeira estrutura cristalogr´afica do CCD da TrCel7A, obtida em 1994 [132], revelou que o CCD ´e formado por um sandu´ıche de folhas β anti-paralelas, no in- terior do qual reside um n´ucleo fortemente hidrof´obico. Acima das folhas β, h´a um longo canal coberto por loops, que d´a `a TrCel7A um s´ıtio de liga¸c˜ao ao substrato na forma de t´unel (figuras 5.2 e 5.3). Uma vez que o substrato se liga `a TrCel7A, os loops do t´unel catal´ıtico impedem sua dissocia¸c˜ao. Assim, a TrCel7A executa v´arios ciclos catal´ıticos sobre uma ´unica cadeia polissacar´ıdica, atrav´es de um me- canismo de hidr´olise processiva. Estes longos e numerosos loops da TrCel7A s˜ao os elementos estruturais que a caracterizam como celobiohidrolase. A endoglucanase Cel7B de T. reesei apresenta alta identidade sequencial com a TrCel7A, exceto pelas dele¸c˜oes nos loops que formam o t´unel catal´ıtico. Isso confere `a Cel7B, e ou- tras endoglucanases, uma estrutura completamente aberta, apta a clivar, de forma n˜ao-processiva, liga¸c˜oes glicos´ıdicas atrav´es de ataques endoglucol´ıticos em pontos aleat´orios da celulose [133].

Uma s´erie de estruturas cristalogr´aficas de mutantes cataliticamente deficientes da TrCel7A foram obtidas em 1998 na presen¸ca de oligossacar´ıdeos [134]. Tais

5.1. Introdu¸c˜ao 63

Figura 5.2. Estrutura cristalogr´afica do CCD da TrCel7A (PDB: 8CEL [134]). As folhas β (azul) formam um canal acima do qual h´a v´arios loops (branco) e α-h´elices (amarelo) que formam um t´unel. Neste t´unel, h´a res´ıduos polares e 4 triptofanos (vermelho), onde se liga uma cadeia polissacar´ıdica (verde) para ser hidrolisada pelos res´ıduos catal´ıticos (alaranjado).

Figura 5.3. Superf´ıcie molecular do CCD da TrCel7A, mostrando a topo- logia de t´unel criada pelos loops.

estruturas revelaram a existˆencia de 10 subs´ıtios de liga¸c˜ao ao longo do t´unel ca- tal´ıtico, onde se ligam os monˆomeros de glicose da cadeia polissacar´ıdica (figura 5.3). As principais intera¸c˜oes enzima-substrato s˜ao liga¸c˜oes de hidrogˆenio envol- vendo, principalmente, res´ıduos de Gln e Asn, e intera¸c˜oes hidrof´obicas do tipo stacking com 4 res´ıduos de Trp dispostos ao longo do t´unel (figura 5.3). Com base

nestes estudos de cristalografia, foi sugerido que tais res´ıduos de Trp seriam im- portantes na processividade, pois permitiriam que o substrato deslizasse ao longo do t´unel catal´ıtico [134].

M´odulo de liga¸c˜ao ao carboidrato (CBM)

M´odulos de liga¸c˜ao ao carboidrato (CBM) s˜ao dom´ınios n˜ao-catal´ıticos presentes em glicos´ıdeo hidrolases, cuja fun¸c˜ao prim´aria ´e o reconhecimento e liga¸c˜ao da en- zima ao substrato. Como as GHs, os CBMs s˜ao classificados em fam´ılias, com base em similaridades sequenciais [135]. O CBM da TrCel7A ´e um pequeno dom´ınio de 36 res´ıduos [136], adaptado ao reconhecimento da superf´ıcie da celulose cris- talina atrav´es de trˆes res´ıduos arom´aticos arranjados de forma planar (figura 5.4) [135]. CBMs semelhantes ao da TrCel7A ocorrem em outras GHs que se ligam a superf´ıcies cristalinas de celulose ou de quitina, e s˜ao classificados como CBMs do tipo A [135]. H´a evidˆencias de que o CBM esteja envolvido em trˆes fun¸c˜oes [4, 71]: (1) aumento da concentra¸c˜ao da enzima sobre o substrato celul´osico; (2) direcio- namento da enzima para alguma extremidade de uma cadeia polissacar´ıdica; (3) modifica¸c˜oes da estrutura cristalina da celulose. A presen¸ca do CBM ´e importante para a atividade da TrCel7A sobre substratos insol´uveis, mas n˜ao sobre substratos sol´uveis [71]. Simula¸c˜oes computacionais mostram que o CBM se liga seletivamente sobre a face hidrof´obica da celulose [137], exibindo m´ınimos de energia a cada uni- dade de celobiose da superf´ıcie da celulose [138], que coincide com o comprimento de um ciclo processivo da TrCel7A.

Figura 5.4. Estrutura tridimensional do CBM (PDB: 1CBH [136]) da TrCel7A, mostrando a superf´ıcie arom´atica de liga¸c˜ao `a celulose.

5.1. Introdu¸c˜ao 65 Linker

Por ser desestruturado [4, 139], n˜ao h´a estruturas cristalogr´aficas resolvidas para o linker, mas estudos de espalhamento de raios X a baixo ˆangulo (SAXS) revelam seu comprimento em solu¸c˜ao [140], que varia dependendo de seu estado de glicosila¸c˜ao e de sua sequˆencia prim´aria, o que, por sua vez, ´e dependente do microrganismo [141]. Simula¸c˜oes de dinˆamica molecular mostram que o linker possui propriedades el´asticas em solu¸c˜ao [139, 141, 142], e, dependendo da sequˆencia de amino´acidos, pode exibir uma distribui¸c˜ao de comprimentos bimodal [143]. Recentemente, si- mula¸c˜oes partindo da configura¸c˜ao ilustrada na figura 5.1 mostraram que, na escala de tempo de 1 µs, o linker glicosilado colapsa sobre a superf´ıcie da celulose, suge- rindo seu papel de liga¸c˜ao da TrCel7A `a celulose (figura 5.5) [131]. Experimentos de calorimetria com CBM isolado e com a constru¸c˜ao CBM-linker mostraram que este ´ultimo se liga `a celulose com maior afinidade que o CBM isolado, corroborando os resultados das simula¸c˜oes [131].

Figura 5.5. Colapso do linker glicosilado sobre a superf´ıcie da celulose observado em 1 µs de dinˆamica molecular a partir da estrutura ilustrada na figura 5.1. Adaptado da referˆencia [131].