Constru¸c˜ ao dos sistemas

EXLX1 nativa

As coordenadas iniciais da expansina EXLX1 foram tomadas da estrutura crista- logr´afica obtida por Kerff et al. (c´odigo PDB: 3D30) [260]. ´Atomos de hidrogˆenio foram adicionados de acordo com valores de pKa em pH=7, estimados usando o

servidor H++ [169, 170]. O pH neutro foi escolhido considerando que a EXLX1 ´

e ativa em valores de pH variando de 5,5 a 9,5 [264]. A estrutura foi ent˜ao sol- vatada por uma caixa retangular contendo mol´eculas de ´agua e ´ıons Na+ _{e Cl}−

na concentra¸c˜ao de 0,15 M, com excesso de contra-´ıons para neutralizar o sistema eletricamente. A caixa de simula¸c˜ao foi constru´ıda com o programa Packmol [237] de tal forma que a distˆancia m´ınima entre a prote´ına e as extremidades da caixa fosse de 16 ˚A. A estrutura assim constru´ıda foi ent˜ao submetida ao seguinte pro- cedimento: (1) com todos os ´atomos da EXLX1 fixos, 1000 passos de minimiza¸c˜ao de energia com gradientes conjugados seguidos de 200 ps de dinˆamica molecular; (2) com todos carbonos α da EXLX1 fixos, 1000 passos de minimiza¸c˜ao de energia com gradientes conjugados seguidos de 200 ps de dinˆamica molecular; (3) 600 ps de dinˆamica molecular com todos os ´atomos livres. Ap´os estas etapas de prepara¸c˜ao, uma trajet´oria de 150 ns foi obtida e utilizada para as an´alises.

Mutantes Asp82Asn e Tyr73Ala

Da simula¸c˜ao de 150 ns da EXLX1 nativa, uma configura¸c˜ao foi tomada aleatori- amente – j´a que as configura¸c˜oes ao longo dos 150-ns de simula¸c˜ao diferem pouco entre si – para construir os sistemas dos mutantes Asp82Asn e Tyr73Ala. As coor- denadas dos res´ıduos mutantes foram inseridas conforme as coordenadas internas do campo de for¸ca CHARMM22 [172]. Para o mutante Asp82Asn, um c´ation Na+ foi removido para compensar a substitui¸c˜ao do res´ıduo Asp negativamente carre- gado pelo res´ıduo Asn eletricamente neutro. Ambos os sistemas foram submetidos a 100 passos de minimiza¸c˜ao de energia seguidos de 10 ns de dinˆamica molecular, com todos os ´atomos livres. Uma trajet´oria de 150 ns foi ent˜ao gerada para cada

7.2. Metodologia 117 um dos mutantes.

EXLX1 sobre celulose cristalina

Para as simula¸c˜oes envolvendo a celulose cristalina, o modelo hexagonal de fibrila elementar de 36 cadeias foi empregado (figura 2.4a) [14]. Uma fibrila elementar de celulose cristalina Iβ, de grau de polimeriza¸c˜ao 24, foi gerada com o programa cellulose-builder [9, 270]. Este grau de polimeriza¸c˜ao foi escolhido de forma que o comprimento da fibrila fosse aproximadamente duas vezes o tamanho da EXLX1. Para estudar o processo de adsor¸c˜ao, a EXLX1 foi colocada a aproximadamente 10 ˚A da superf´ıcie hidrof´obica da celulose numa orienta¸c˜ao em que a superf´ıcie arom´atica do dom´ınio D2 est´a paralela `a superf´ıcie. Uma camada de ´agua de pelo menos 20 ˚A da EXLX1 ou da celulose foi criada usando Packmol [237]. Tal arranjo permitiu que mol´eculas de ´agua ocupassem o espa¸co entre a EXLX1 e a superf´ıcie da celulose, de forma que o processo de adsor¸c˜ao pudesse ser observado. Antes de gerar uma trajet´oria de 50 ns – tempo suficiente para a EXLX1 se adsorver sobre a celulose – em temperatura e volume constantes, o sistema foi preparado com o seguinte procedimento: (1) 1000 passos de minimiza¸c˜ao de energia seguidos de 500 ps de dinˆamica molecular com todos os ´atomos da EXLX1 e da celulose fixos; (2) 1000 passos de minimiza¸c˜ao de energia seguidos de 2 ns de dinˆamica molecular com todo o sistema livre. O passo (1) foi executado para permitir a relaxa¸c˜ao da camada de ´agua entre a EXLX1 e a celulose e o passo (2) para equilibrar a temperatura e a densidade do sistema (esta etapa foi feita com temperatura e press˜ao constantes). Para estudar a dinˆamica da EXLX1 adsovida sobre a celulose, as coordenadas do complexo EXLX1-celulose foram tomadas do final da simula¸c˜ao de adsor¸c˜ao e uma nova caixa de simula¸c˜ao foi constru´ıda, dessa vez com uma camada de ´agua mais fina, mas ainda com pelo menos 20 ˚A de distˆancia entre as extremidades da caixa e o complexo EXLX1-celulose. Uma simula¸c˜ao de 200 ns foi ent˜ao executada ap´os a repeti¸c˜ao das mesmas etapas de prepara¸c˜ao (1) e (2) da simula¸c˜ao de adsor¸c˜ao.

EXLX1 ligada a cadeia de glucano

A estrutura inicial da EXLX1 complexada com um oligossacar´ıdeo foi obtida to- mando as coordenadas da EXLX1 e da cadeia de glucano alinhada `a superf´ıcie arom´atica no complexo EXLX1-celulose. Este sistema (sem solvente) foi ent˜ao sub- metido a 10.000 passos de minimiza¸c˜ao de energia seguidos de 200 ps de dinˆamica molecular com a EXLX1 fixa. Isso foi feito para permitir o oligossacar´ıdeo se ajus- tar a ambos os dom´ınios D1 e D2 da EXLX1. Ap´os este procedimento, o sistema foi solvatado por uma camada de ´agua de pelo menos 16 ˚A numa caixa retan- gular contendo NaCl na concentra¸c˜ao de 0,15 M. Contra-´ıons em excesso foram adicionados para neutralizar o sistema. Para relaxar/equilibrar o sistema, foram adotados os mesmos passos usados para o sistema da EXLX1 nativa na ausˆencia de substrato. Inicialmente, uma trajet´oria de 200 ns foi gerada. Nos primeiros 100 ns, o substrato permaneceu ligado a ambos os dom´ınios D1 e D2. Ap´os este per´ıodo, o substrato se dissociou do dom´ınio D1 e come¸cou a explorar conforma¸c˜oes no meio. Para aumentar a amostragem, trˆes novas simula¸c˜oes foram executadas partindo de estruturas tomadas aleatoriamente dos primeiros 100 ns da simula¸c˜ao (as configura¸c˜oes diferem pouco entre si). Destas trˆes, o substrato permaneceu no estado ligado durante os primeiros 60, 38 e 32 ns. A dissocia¸c˜ao do substrato do dom´ınio D1 ´e esperada, j´a que este dom´ınio n˜ao possui fun¸c˜ao de liga¸c˜ao, que ´e exercida pelo dom´ınio D2 [264]. As estruturas com substrato complexado foram ent˜ao reunidas e utilizadas para an´alise.