Como mencionado anteriormente, a ausência das proteínas CopA e CopB no mutante XAC3629::Tn pode ser devido à falta do produto da ORF XAC3629. Assim, decidimos investigar se a proteína da ORF XAC3629 é realmente sintetizada in vivo pela linhagem selvagem Xac 306. Para isso, uma abordagem de construção de uma linhagem mutante de
Xac que expresse o produto do gene fusionado à proteína TAP, foi utilizada. A ORF inteira foi
clonada no vetor de expressão pHF5Ca, sob o controle do promotor de xilose para produzir a ORF XAC3629 fusionada à TAP na extremidade C-terminal. Após a transformação de Xac 306, o plasmídeo suicida permitiu a integração cromossômica tanto no locus da ORF XAC3629, portanto levando à expressão da proteína fusionada à TAP sob o controle do promotor nativo (pXAC3629), como no locus Amy (α-amilase), levando à expressão da proteína fusionada à TAP mas sob o controle do promotor de xilose (pXyl). Os diferentes eventos de integração foram verificados por análise do crescimento de diferentes clones em meio TSA contendo amido 1% (Figura 25).
Os clones mostrando a integração cromossômica sob o controle do promotor nativo, pXAC3629, foram capazes de degradar amido, tal como a linhagem selvagem e formaram um halo no meio de cultura. Os clones com integração no locus Amy (α-amilase), sob o controle do promotor xilose não foram capazes de degradar amido e, portanto, não formaram halo no meio de cultura. Os clones de ambos os eventos foram analisados quanto à produção do produto da ORF XAC3629 fusionado à TAP, por ensaios de Western blot conforme descrito no item 10.1 da seção Materiais e Métodos.
Inicialmente, o produto de fusão XAC3629-TAP foi produzido em células de E. coli. Foram incluídos neste ensaio a construção pHF5Ca-ZapA (UCCI e FERREIRA, resultados não publicados), a qual expressa a proteína ZapA fusionada à TAP como um controle positivo e o plasmídeo vazio, pHF5Ca, como um controle negativo. Amostras de células foram coletadas antes e após a indução com xilose e uma banda proteica de aproximadamente 35 kDa foi
106
observada nas amostras do controle positivo (Figura 26A). Clones transformados com o vetor vazio (pHF5Ca) expressaram a proteína TAP de 20 kDa. Uma banda muito fraca de aproximadamente 37 kDa, correspondente ao produto de fusão XAC3629-TAP foi visualizada em células transformadas com a construção pHF5Ca-XAC3629, indicando que as células de E.
coli expressaram o produto XAC3629-TAP em níveis muito baixos.
A produção da ORF XAC3629-TAP em células de Xac foi analisada utilizando-se dois clones diferentes, nos quais a transcrição do gene estava sob o controle do promotor da ORF XAC3629, pXAC3629 ou do promotor de xilose, pXyl, na ausência e presença de cobre (Figura 26B). O produto de fusão, XAC3629-TAP, foi observado apenas nas células cuja transcrição estava sob o controle do pXyl. O produto XAC3629-TAP não foi detectado quando a transcrição estava sob o controle do promotor nativo (pXAC3629), mesmo após a adição de 1mM de CuSO4.5H2O, sugerindo que a proteína XAC3629 não é sintetizada in vivo ou é sintetizada em níveis não detectáveis pela abordagem utilizada neste trabalho, portanto, pode tratar-se de uma sequência regulatória.
Figura 25- Análise de transformantes de Xac 306 com o produto da ORF XAC3629 fusionado a
TAP. (A) clones com capacidade de degradação de amido, integração da XAC3629-TAP no
locus nativo da XAC3629. (B) clones sem degradação de amido, integração da XAC3629-TAP
no locus Amy (α-amilase). (C) amostra de Xac 306 selgavem. Transformantes selecionados em
kanamicina e inoculados em meio TSA com amido 1%, crescimento a 28°C por 3 dias. Coloração da placa com lugol 0,1 M.
A
B
C
107
Figura 26- Avaliação da expressão do produto da ORF XAC3629 por Western blot. (A)
Expressão em células de E. coli. As construções plasmidiais pHF5Ca-ZapA (controle positivo) e pHF5Ca-XAC3629 foram utilizadas para transformar células de E. coli e a produção foi analisada em amostras coletadas antes e após a indução com xilose. pHF5Ca, clones transformados com o vetor vazio expressam a proteína TAP de 20 kDa. (B) Expressão em
células de Xac 306. Uma quantidade de 60 µg de proteína total foi colocada em cada canaleta. pXAC3629, células que expressam o produto de fusão XAC3629-TAP sob o controle do promotor nativo. pXyl, células que expressam o produto de fusão XAC3629-TAP sob o controle do promotor pXyl. NI, células não induzidas, 2 e 4, tempo (h) após a indução com xilose. As proteínas totais foram fracionadas em gel de SDS-PAGE 12%, transferidas para membranas de nitrocelulose e detectadas com o anticorpo anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase (Sigma). Os números do lado esquerdo indicam os pesos moleculares em kDa.
A
108
Considerações Finais
109
CONSIDERAÇÕES FINAIS
-Nesse trabalho mostramos que existe uma diferença de tolerância ao cobre entre os isolados de Xac de diferentes Estados do Brasil, com um aumento de tolerância ao cobre nos estados do Sul do Brasil, principalmente nos Estados do Paraná, Rio Grande do Sul e Santa Catarina, que podem ter recebido aplicações regulares de bactericidas cúpricos nos últimos anos. A aplicação frequente de produtos cúpricos pode levar à seleção de linhagens de Xac com maior tolerância ou mesmo resistente ao produto.
-No Estado de São Paulo, com a política de erradicação de árvores doentes e menor volume de aplicação de cobre, a população de Xac presente nos pomares cítricos mostrou-se mais sensível ao tratamento com cobre. Entretanto esse perfil pode mudar devido ao aumento nos níveis de incidência da doença nos últimos anos. Este aumento vem ameaçando a citricultura já que a fiscalização de plantas e ou talhões contaminados deixou de ser uma obrigação a partir de 2009, ficando sob responsabilidade do produtor o controle da doença.
-A análise de tolerância a cobre confirmou que a inativação da ORF XAC3629 produz estirpes mutantes de Xac muito sensíveis a cobre, incapazes de crescer em concentrações de 0,25 mM CuSO4.5H2O. Entretanto a linhagem selvagem Xac A44 mostrou uma sobrevivência elevada em cobre (acima de 1,0 mM CuSO4.5H2O) quando comparada às demais linhagens testadas. A maior contribuição para a resistência a cobre nessa linhagem deve-se, em parte, ao sistema plasmidial (copLABMGCDF) presente, adicional ao sistema cromossomal (copLAB). -Todos os isolados de Xac dos diferentes Estados avaliados, confirmados por PCR, apresentaram o mesmo perfil na organização genômica das ORFs envolvidas no mecanismo de homeostase de cobre em Xac. Tanto os isolados mais tolerantes ao cobre como os mais sensíveis apresentaram aparentemente o mesmo tamanho da região contendo o operon copAB e a ORF XAC3629. Uma diferença no tamanho dessa região, por deleção ou por inserção de alguma outra sequência nucleotídica, poderia ter explicado as diferenças de sensibilidade a cobre encontradas nos isolados de Xac.
- A inativação da ORF XAC3629 em Xac levou a não expressão da mesma e do operon
copAB, indicando que a sequência da XAC3629 pode conter elementos de DNA regulatórios
envolvidos na regulação da expressão do operon copAB. A ORF XAC3629 não é parte do operon copAB, situa-se 108 nucleotídeos upstream ao operon e é transcrita de forma independente do operon. Embora não sejam geneticamente ligados, a inativação da ORF levou a não expressão do operon copAB. A inativação da ORF XAC3629 reduz drasticamente a tolerância ao cobre devido a não expressão das proteínas CopA e CopB.
-O transcrito da ORF XAC3629 nas linhagens selvagens de Xac, A44, 306 e 616, foi detectado na ausência de cobre, entretanto observou-se um aumento da expressão gênica na
110
presença do metal. O isolado Xac 616, tolerante a cobre, expressou uma quantidade maior do transcrito da ORF XAC3629 na ausência de cobre. A expressão do operon copAB nas linhagens selvagens foi altamente induzida por cobre e um aumento expressivo foi observado na linhagem Xac A44 mais resistente ao metal e com dois sistemas de resposta ao cobre.
-Nesse trabalho mostramos que a região 5’-flanqueadora do operon copAB contêm elementos de DNA regulatórios que são ligados por proteínas ativadas por cobre e que a ORF XAC3629 parece ser primordial nessas interações. Além disso mostramos através da construção de uma linhagem mutante de Xac, com a XAC3629 fusionada a uma Tag, que a proteína da ORF XAC3629 não é sintetizada in vivo em Xac ou é sintetizada em níveis não detectáveis pela abordagem utilizada, portanto, pode tratar-se de uma sequência regulatória.
-Algumas proteínas identificadas por espectrometria de massas nas frações utilizadas nos ensaios de EMSA podem ligar-se a região 5’-flanqueadora do operon copAB. Essas proteínas fazem parte de diferentes sistemas que podem contribuir para a homeostase de cobre em X. citri subsp. citri, tanto envolvidas na translocação do metal como na resposta aos subprodutos gerados pelo cobre. Análises funcionais adicionais são necessárias para desenharmos um modelo de como essas proteínas interagem entre si, com o cobre e/ou com a região que regulam.
- Em relação a expressão diferencial de proteínas em presença de cobre, observamos que muitas proteínas altamente induzidas em cobre respondem ao estresse oxidativo causado pelo metal, sendo essas proteínas identificadas em maior número na linhagem Xac A44. As proteínas dos sistemas de resistência a cobre (copAB) também foram induzidas na linhagem
Xac A44.
- Com relação a linhagem Xac 306, proteínas interessantes foram expressas em presença de cobre, como as proteínas dos sistema de dois componentes que podem controlar vários processos celulares, as proteínas de ligação a ATP dos transportadores ABC e várias proteínas ligadas a fatores de patogenicidade e adaptação (categoria proteica VII) que podem funcionar como sistemas de defesa contra o cobre. As funções específicas dessas proteínas em presença de cobre devem ser investigadas em maiores detalhes em estudos futuros.
- Este trabalho permitiu o aprofundamento dos conhecimentos sobre homeostase e resistência a cobre em X. citri subsp. citri. O conhecimento das proteínas sensoras, responsivas ao metal, seus genes-alvo e dos fatores que influenciam suas especificidades podem ajudar na compreensão dos mecanismos de resposta ao cobre nos organismos procariotos, entre os quais se encontram as bactérias fitopatogênicas.
111
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