4. Análise do DNA genômico de linhagens selecionadas por Southern Blot
6.1. Ensaio de ligação do extrato proteico bruto de Xac aos fragmentos de
A interação DNA-proteína foi primeiramente avaliada com o extrato proteico bruto das linhagens Xac 306 e Xac A44 produzido após 4 h de contato com 1mM de CuSO4.5H2O e analisado com as sondas radioativas de 625 pb e 600 pb da região 5’-flanqueadora do operon
copAB, conforme descrito no item 6 da seção Materiais e Métodos. Essas mesmas sondas,
sem sofrer marcação radioativa, foram utilizadas como competidores específicos (CE) nos ensaios de EMSA e adicionadas à reação de ligação em excesso molar de 15 a 30X.
Os resultados de ligação das proteínas do extrato proteico bruto de Xac 306 e Xac A44 com os dois fragmentos DNA maiores da região upstream ao operon copAB estão apresentados na Figura 18B. Como mostrado, os complexos DNA-proteínas indicados por setas foram observados com o extrato celular bruto proteico de Xac com ambos os fragmentos da região 5’-flanqueadora do operon copAB. A especificidade dessas ligações foi confirmada com a utilização do competidor específico em excesso molar de 30X à sonda, adicionado 10 minutos antes da reação de ligação radioativa. As proteínas do extrato bruto de Xac A44 mostraram resultados idênticos às proteínas do extrato bruto de Xac 306 (Figura 18B).
6.2. Ensaio de ligação de frações proteicas de Xac 306 aos fragmentos de DNA da região 5’-flanqueadora do operon copAB
Nesse ensaio o extrato proteico bruto de Xac 306 foi fracionado em coluna de Heparina- Sepharose com o objetivo de concentrar proteínas com maior probabilidade de ligação ao DNA. As proteínas foram eluídas com um gradiente linear de 0,1 a 1,5 M de KCl e as frações proteicas analisadas por ensaios de EMSA quanto à capacidade de ligação a diferentes fragmentos de DNA da região 5’-flanqueadora do operon copAB.
Os resultados de ligação das proteínas das frações proteicas de Xac 306 com o DNA de diferentes fragmentos da região em análise estão apresentados nas Figuras 19 e 20. Durante o
fracionamento do extrato celular bruto de Xac 306 um pico suave foi observado entre as frações 2 e 13 coletadas (cromatograma, Figura 19A), as quais foram escolhidas para os ensaios de EMSA. A Figura 19B refere-se aos ensaios de alteração de mobilidade
77
Figura 18- Ligação de proteínas de Xac a região upstream do operon copAB. (A) Localização
do operon copAB juntamente com a ORF XAC3629 no genoma de Xac. Os respectivos primers utilizados para a amplificação da região upstream ao operon copAB estão indicados assim como as enzimas de restrição utilizadas para obtenção dos fragmentos menores. O tamanho
esperado dos fragmentos genômicos utilizados nos ensaios de EMSA está representado. (B)
Extrato bruto proteico da linhagem Xac 306 (60 µg) foi utilizado nos ensaios de EMSA com dois fragmentos da região. Fragmentos de 625 pb (canaletas de 1-3) e 600 pb (canaletas de 4-6). O competidor de DNA específico (CE) foi adicionado previamente à sonda em excesso molar de 30X (canaletas 3 e 6). Canaleta 1- sonda de 625 pb, nenhuma proteína adicionada, 4- sonda de 600 pb, nenhuma proteína adicionada. O- origem do gel, CE- competidor específico, SL- sonda livre. Os complexos de DNA-proteína estão indicados por setas.
1 2 3 4 5 6 CE - - 30 - - 30 Proteína - + + - + + EagI CopARP 3629Ri XacF copAB XAC3629 295 bp 240 bp 3629F 238 bp 362 bp EagI SacII 90 bp S1 S2 S4 S3 625 bp 600 bp
A
B
78
eletroforética com os dois fragmentos maiores da região upstream ao operon copAB, de 625 pb e 600 pb. Como mostrado, complexos DNA-proteínas indicados por setas, foram observados com várias frações proteicas obtidas por cromatografia em Heparina-Sepharose (canaletas de 10 a 15, Figura 19B) e com os extratos proteicos brutos de Xac A44 e Xac 306 (canaletas 2 e 3, respectivamente). O fragmento de 600 pb mostrou o mesmo perfil de resultado observado para o fragmento de 625 pb (mostrado na Figura 19B).
Os resultados apresentados na Figura 20 referem-se a esses mesmos fragmentos de 625 pb e 600 pb, clivados por enzimas de restrição e testados apenas com uma fração cromatográfica de Heparina-Sepharose (fração 13, mostrada na canaleta 15 da Figura 19B). Os fragmentos de 240 pb (S1), 295 pb (S2), 238 pb (S3) e de 362 pb (S4) também mostraram a formação de complexos DNA-proteínas, indicados por seta, que não foram visualizados na presença do competidor específico (CE) usado em excesso molar de 30X à sonda (Figura 20). Os resultados sugerem que as ligações DNA-proteínas com os fragmentos de 295 pb (S2) e 362 pb (S4) pareceram ser mais específicas, devido a melhor definição do complexo formado. O fragmento de 362 pb (S4) contém praticamente a ORF XAC 3629 inteira. Os mesmos resultados (Figura 20) foram observados com outras frações cromatográficas obtidas em coluna de Heparina-Sepharose (frações mostradas nas canaletas de 11 a 13, Figura 19B).
Os resultados de EMSA mostraram que a região 5'-flanqueadora do operon copAB contêm elementos de DNA regulatórios que são ligados por proteínas, algumas ativadas por cobre. Essas proteínas podem fazer parte de diferentes sistemas que contribuem para a homeostase e resposta ao cobre em X. citri subsp. citri, tanto envolvidas na translocação do metal como de resposta aos subprodutos gerados pelo cobre. Diante desses resultados foi investigado quais proteínas seriam essas e quais seriam diferentemente expressas por isolados com resistência variada ao cobre. Realizamos essas avaliações através de análises proteômicas acopladas à espectrometria de massa.
7. Análise de frações proteicas de Xac 306 por eletroforese bidimensional (2D-PAGE)
Duas frações cromatográficas obtidas em Heparina-Sepharose (frações 9 e 10, canaletas 11 e 12, da Figura 19B) que mostraram ligações DNA-proteínas, tiveram suas proteínas identificadas por análises proteômicas conforme descrito no item 7 da seção Materias e Métodos. Todas as proteínas reveladas em gel de poliacrilamida foram selecionadas para as análises por espectrometria de massa e as pesquisas de homologia foram realizadas no Banco de Dados XAC052012 do Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), Campinas.
79 Lavagem da Coluna - Perfil de Eluição em Gradiente Linear - Eluição em 100% Tampão B
Volume eluído (mL) Volume eluído (mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Proteína - + + + + + + + + + + + + + +
Figura 19- Fracionamento do extrato proteico bruto de Xac 306, seguido de ensaio de EMSA
para análise das frações cromatográficas. (A) Cromatograma das etapas de fracionamento do
extrato proteico em coluna de Heparina-Sepharose, utilizando um gradiente linear de 0,1 a 1,5
M de KCl. As setas indicam o intervalo correspondente às fraçoes coletadas. (B) Ligação de
proteínas de Xac à região upstream do operon copAB. Frações cromatográficas avaliadas com o fragmento de 625 pb (canaletas de 1-15). A ligação foi realizada com 80 µg de proteína de cada fração cromatográfica (canaletas de 4 a 15). Complexos de DNA-proteína foram visualizados com as frações proteicas nas canaletas 2, 3, 10, 11, 12, 13 e 15 e estão indicados por setas. Canaleta 1- sonda livre, nenhuma proteína adicionada. Canaletas 2 e 3- ligação de proteínas do extrato celular bruto de Xac A44 e Xac 306, respectivamente. O- origem do gel, SL- sonda livre. Os complexos de DNA-proteína estão indicados por setas.
A
B
mAu80 CE - - 30 - - 30 - - 30 - - 30 Proteína - + + - + + - + + - + + S1 S2 S3 S4
Figura 20- Análises de EMSA da região 5’-flanqueadora do operon copAB. Fração
cromatográfica 13 (canaleta 15 da Figura 19B, 80 µg) analisada com os fragmentos de DNA menores upstream do operon copAB. S1, sonda de 240 pb (canaletas de 1-3); S2, sonda de 295 bp (canaletas de 4-6); S3, sonda de 238 bp (canaletas de 7-9) e S4, sonda de 362 bp (canaletas de 10-12). O competidor de DNA específico (CE) foi adicionado previamente a sonda em excesso molar de 30X. Canaletas 1, 4, 7 e 10, sonda livre, nenhuma proteína acrescentada. O- origem do gel, CE- competidor específico, SL- sonda livre. Os complexos de DNA-proteína estão indicados por setas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 SL
81
extensiva da proteína com significancia p<0.05. As proteínas foram consideradas quando os valores de massa molecular e pI experimentais encontraram-se condizentes com os dados teóricos das proteínas identificadas. O perfil proteico das duas frações utilizadas nessas análises, frações 9 e 10 da coluna de Heparina-Sepharose, está apresentado na Figura 21.
Na Figura 21A estão apresentadas as proteínas da linhagem Xac 306 presentes na fração 9 e na Figura 21B estão apresentadas as proteínas da fração 10, ambas fracionadas a partir de um extrato celular de Xac 306 coletado após 4 h de contato com 1 mM de CuSO4.5H2O. Em relação à fração 10 (Figura 21B), a focalização isoelétrica não foi adequada, mostrando um perfil proteico com alguns arrastes em determinados pI, o que dificulta a identificação proteica nesses locais. Observa-se também, nas duas frações analisadas, uma concentração maior de proteínas próxima ao pI 7. Como a coluna de Heparina-Sepharose possue muitas cargas negativas é natural que proteínas com mais cargas positivas sejam selecionadas, o que pode aumentar o pI resultante das proteínas avaliadas em cada fração cromatográfica. O objetivo de usarmos uma coluna de Heparina-Sepharose nessa avaliação foi o de selecionarmos proteínas com maior probabilidade de ligação a fragmentos de DNA.
As proteínas de Xac 306 identificadas por espectrometria de massas nas frações 9 e 10, organizadas por categorias proteicas (de I a IX) segundo anotação do genoma de Xac, estão respectivamente apontadas nas Tabelas 3 e 4. Na fração 9 (Tabela 3) foram identificadas 31% de proteínas envolvidas na biossíntese de pequenas moléculas (II) como aminoácidos, nucleotídeos e ácidos graxos e fosfatídico, 27% envolvidas no metabolismo de macromoléculas (III) como DNA, RNA e proteínas, 19% envolvidas em metabolismo intermediário (I) como metabolismo do carbono, degradação de lipídeos e mecanismos regulatórios, 4% envolvidas com processos celulares (V) de transporte, 12% com mecanismos de patogenicidade e adaptação (VII) e 8% das proteínas identificadas foram classificadas como proteínas hipotéticas (VIII). Na fração 10 (Tabela 4) foram identificadas 9% de proteínas envolvidas na biossíntese de pequenas moléculas (II) como aminoácidos e ácidos graxos e fosfatídico, 52% envolvidas no metabolismo de DNA, RNA e proteínas (III), 9% envolvidas em mecanismos regulatórios e metabolismo do carbono (I), 9% envolvidas com estruturas celulares (IV) de membrana, 9% com mecanismos de patogenicidade e adaptação (VII) e 12% das proteínas identificadas foram classificadas como proteínas hipotéticas (VIII).
Na fração 10 de EMSA (canaleta 12, Figura 19B) observamos a formação de complexos DNA-proteínas com pesos moleculares maiores, o que condiz com o maior número de proteínas encontradas nessa fração envolvidas no metabolismo de macromoléculas (52%). As proteínas de ligação a DNA nessa fração, em maior número, têm maior probabilidade de participar das interações observadas. Como estamos interessados nos mecanismos de homeostase do metal cobre podemos destacar algumas proteínas que podem ter funções
82
Figura 21- Perfil proteico de frações de Xac 306 em 2D-PAGE. (A) Fração 9 do extrato proteico
de Xac 306. (B) Fração 10 do extrato proteico de Xac 306. O extrato proteico de Xac,
fracionado em Heparina-Sepharose, foi coletado após 4 h de contato com 1 mM de CuSO4.5H2O. O Peso Molecular (kDa) está indicado ao lado dos géis. A focalização das
proteínas foi feita em um gradiente de pH entre 4 a 7. Eletroforese em gel SDS-PAGE 12,5%, corado com Coomassie Brilliant Blue R-250.
A
83
importantes nesse mecanismo e apareceram nas frações cromatográficas analisadas assim como em algumas das avaliações de expressão diferencial em cobre que mostraremos a seguir. Por exemplo, a proteína reguladora de sequestro de ferro, codificada pela XAC1517, a proteína de ligação a ATP do transportador ABC, produto do gene XAC0741, a proteína fructose-bisphosphate aldolase, XAC3344 e as proteínas como catalase, XAC1211 (enzima que participa na proteção ao estresse por peróxido), fosfoglucomutase, XAC3579, fosfomanose isomerase, XAC3580, a ribosiltransferase RNAt de queuina, XAC2513, a trealose 6-fosfato sintase, XAC3211, todas associadas a fatores de patogenicidade e adaptação e as proteínas hipotéticas, como a codificada pela ORF XAC3725 com identidade de 87% à proteína de resposta a estresse, a proteína YciF de Stenotrophomonas maltophilia, com domínio de ligação a ferro similar a ferritina, e com vários sitios de ligação a metal.
Essa proteína (YciF) possui 67% de identidade com YciF de E. coli (HINDUPUR et al., 2006), a qual pertence ao operon yciGFE. A proteína YciF foi identificada em nossos estudos quando a estirpe Xac 306 foi exposta a 1 mM de CuSO4 e quando células de X. axonopodis pv. passiflorae foram expostas ao extrato foliar da planta (TAHARA; MEHTA; ROSATO, 2003). Trata-se de uma proteína de função desconhecida, no entanto, sua estrutura cristalina revelou a existência de potenciais locais de ligação de metal, muito conservados entre os homólogos de outras bactérias e mostrou uma identidade de sequência baixa com uma proteína de ligação a DNA de Halobacterium salinarum (HINDUPUR et al., 2006). Outra proteína identificada nessas avaliações é a codificada pela ORF XAC3344, a frutose-bisfosfato-aldolase, uma enzima pertencente as aldolases de classe II que desempenham um papel importante no metabolismo, incluindo a glicólise. Esta enzima foi descrita recentemente ser o principal local de toxicidade de níquel em E. coli (MACOMBER; ELSEY; HAUSINGER, 2011) e foi induzida também quando a linhagem Xac A44 foi exposta a 1 mM de CuSO4.
A proteína reguladora de absorção de ferro, codificada pela ORF XAC1517, gi21107694, pertence à família das proteínas metaloreguladoras Fur (Ferric uptake regulator) possuindo uma hélice putativa de ligação ao DNA, dois sitios de ligação a metal e um domínio de dimerização. Esta proteína foi identificada nas duas frações proteicas que mostraram ligações DNA-proteína nos ensaios de EMSA. Esta família de proteínas compreende proteínas reguladoras de captação de ions metálicos que se ligam ao DNA e ao operador controlando a transcrição de genes que respondem a esses ions, quer como repressor ou ativador transcricional. Essa proteína foi descrita atuar na homeostase de ferro como um sensor e regulador transcricional em X. campestris pv. campestris (JITTAWUTTIPOKA et al., 2010). Este gene que controla a homeostase de zinco e ferro tem sido demonstrado ser importante para a resistência ao estresse oxidativo e na produção de EPS, necessária para a virulência de X.
84
Tabela 3- Proteínas de Xac 306 identificadas na fração cromatográfica 09 da coluna de Heparina-Sepharose.
NCBI
Accession N° Identidade Proteica Categoria* Descrição das Proteínas Score
Sequência
Cobertura (%) MM/ pI (teóricos) Ocorrência** ***
gi21107471 XAC1313 I acyl-CoA dehydrogenase 87 7 42537/ 6,17 IndA44/ Fra09
gi21109692 XAC3344 I fructose-bisphosphate aldolase 195 9 36538/ 4,98 IndA44/Fra09/ Fra10
gi21110034 XAC3651 I ATP synthase alpha chain 69 5 55365/ 5,32
gi21106528 XAC0443 I dihydrolipoamide acyltransferase 104 7 51862/ 5,70 IndA44/ Fra09
gi21107694 XAC1517 I ferric uptake regulator 63 9 15730/ 5,92 Fra09/ Fra10
gi21107840 XAC1650 II 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase 133 8 45714/ 5,68
gi21109007 XAC2725 II chorismate synthase 78 5 39343/ 6,02 IndA44/ Fra09
gi21109005 XAC2723 II aspartate semialdehyde dehydrogenase 89 9 36590/ 4,97
gi21107510 XAC1348 II acetoacetyl-CoA thiolase 197 7 40057/ 6,31 Fra09/ Fra10
gi21110005 XAC3625 II beta-ketoacyl-[ACP] synthase I 138 7 42128/ 5,56
gi21108544 XAC2299 II cytidylate kinase 41 4 24138/ 5,34 Ind306/ Fra09
gi21109749 XAC3395 II guanylate kinase 68 5 22779/ 6,17
gi21108532 XAC2288 II inosine-5'-monophosphate dehydrogenase 92 4 51772/ 6,40
gi21107909 XAC1714 III topoisomerase IV subunit B 336 14 69723/ 6,07
gi21107217 XAC1077 III peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (ATP-independent chaperone) 216 10 48216/ 5,19 IndA44/ Fra09
gi21107092 XAC0957 III elongation factor Tu 172 10 43344/ 5,45 IndA44/ Fra09 RepCu/
85
Tabela 3- continuação
NCBI
Accession N° Identidade Proteica Categoria* Descrição das Proteínas Score
Sequência
Cobertura (%) MM/ pI (teóricos) Ocorrência** ***
gi21108636 XAC2384 III tRNA/rRNA methyltransferase 50 7 27296/ 5,80
gi21107097 XAC0963 III 50S ribosomal protein L10 64 6 18340/ 5,75 IndCu/ Fra09
gi21107089 XAC0951 III 50S ribosomal protein L25 363 18 23393/ 5,12 Fra09/ Fra10
gi21106859 XAC0741 V ABC transporter ATP-binding protein 150 10 61752/ 5,36 IndCu/ IndA44/ Fra09
gi21109955 XAC3579 VII phosphoglucomutase (xanA) 46 6 49337/ 5,19 Ind306/ Fra09 RepCu/ gi21109956 XAC3580 VII phosphomannose isomerase (xanB) 61 2 51043/ 5,57 Ind306/ Fra09
gi21107359 XAC1211 VII catalase 498 17 76678/ 6,55 Fra09/ Fra10
gi21110115 XAC3725 VIII conserved hypothetical protein 196 23 18344/ 5,03 Ind306/ Fra09/ Fra10 gi21110332 XAC3928 VIII conserved hypothetical protein 260 11 71027/ 7,77
*Categorias segundo anotação do genoma de Xac: (I) Metabolismo Intermediário; (II) Biossíntese de Pequenas Moléculas; (III) Metabolismo Macromolecular; (IV) Estrutura Celular; (V) Processos Celulares; (VI) Elementos Genéticos de Mobilidade; (VII) Patogenicidade, Virulência e Adaptação; (VIII) Hipotéticas e (IX) ORFs com categorias indefinidas. **Ocorrência refere-se à frequência de indução ou repressão de uma determinada proteína, sendo (IndCu) indução e (RepCu) repressão da proteína em cobre na linhagem 306, (IndA44) indução da proteína na linhagem A44 em relação a linhagem 306 ambas em cobre, (Ind306) indução da proteína na linhagem 306 em relação a linhagem A44 ambas em cobre e a proteína identificada na (Fra09) fração 09 e na (Fra10) fração10 dos ensaios de EMSA. ***MM refere-se a massa molecular e pI ao ponto isoelétrico da proteína. Score, refere-se ao programa MASCOT derivado da pesquisa de espectrometria de massas.
86
Tabela 4- Proteínas de Xac 306 identificadas na fração cromatográfica 10 da coluna de Heparina-Sepharose.
NCBI
Accession N° Identidade Proteica Categoria* Descrição das Proteínas Score
Sequência
Cobertura (%) MM/ pI (teóricos) Ocorrência** ***
gi21109692 XAC3344 I fructose-bisphosphate aldolase 700 35 36538/ 4,98 IndA44/ Fra09/ Fra10
gi21107722 XAC1542 I fumarate hydratase 125 4 49260/ 8,84
gi21107694 XAC1517 I ferric uptake regulator 128 17 15730/ 5,92 Fra09/ Fra10
gi21108066 XAC1860 II dihydrodipicolinate reductase 225 17 24943/ 7,89
gi21107266 XAC1127 II 3-oxoacyl-[ACP] reductase 60 6 25255/ 6,97
gi21107510 XAC1348 II acetoacetyl-CoA thiolase 283 14 40057/ 6,31 Fra09/ Fra10
gi21109646 XAC3303 III DNA mismatch repair protein 77 6 29521/ 6,88
gi21109032 XAC2747 III metallopeptidase 146 5 72764/ 9,00
gi21107105 XAC0970 III elongation factor Tu 400 22 43344/ 5,45
gi21108224 XAC2002 III initiation factor IF-1 128 47 8370/ 9,45
gi21110195 XAC3800 III 10-Formyltetrahydrofolate:L-methionyl-tRNA N-formyltransferase 56 7 32848/ 9,36
gi21107117 XAC0981 III 30S ribosomal protein S17 42 10 10176/ 9,41
gi21107592 XAC1422 III 30S ribosomal protein S2 96 7 29274/ 8,50
gi21107122 XAC0986 III 30S ribosomal protein S8 68 21 14323/ 9,59
gi21107451 XAC1295 III 50S ribosomal protein L19 142 16 14745/ 10,14
gi21107119 XAC0983 III 50S ribosomal protein L24 252 33 11219/ 10,15
87
Tabela 4- continuação
NCBI
accession n° Identidade Proteica Categoria* Descrição das Proteínas Score
Sequência
Cobertura (%) MM/ pI *** (teóricos) Ocorrência**
gi21107108 XAC0972 III 50S ribosomal protein L3 388 34 22857/ 10,21
gi21107123 XAC0987 III 50S ribosomal protein L6 230 24 18267/ 9,91
gi21109105 XAC2813 III ATP-dependent RNA helicase 393 12 69078/ 8,90
gi21107133 XAC0996 III RNA polymerase alpha subunit 369 21 36455/ 5,58
gi21109748 XAC3394 III RNA polymerase omega subunit 75 12 11193/ 4,54
gi21106870 XAC0751 III transcription termination factor NusB 51 5 17747/ 6,60
gi21109984 XAC3605 IV outer membrane protein 36 3 31440/ 9,57
gi21109958 XAC3582 IV dTDP-4-keto-L-rhamnose reductase 103 4 32185/ 6,13
gi21107319 XAC1176 IV glycosyl hydrolase 256 15 50522/ 6,47
gi21109546 XAC3211 VII trehalose-6-phosphate synthase 78 5 50895/ 6,71 Ind306/ Fra10 gi21108779 XAC2513 VII queuine tRNA-ribosyltransferase 214 16 42441/ 6,54
gi21107359 XAC1211 VII catalase 143 7 76678/ 6,55 Fra09/ Fra10
gi21110082 XAC3695 VIII conserved hypothetical protein 78 4 25839/ 4,61
gi21110115 XAC3725 VIII conserved hypothetical protein 391 37 18344/ 5,03 Fra09/ Fra10 Ind306/ gi46397224 XAC2766 VIII conserved hypothetical protein 168 15 22020/ 5,41
gi21110373 XAC3966 VIII conserved hypothetical protein 125 12 29809/ 5,83
*Categorias segundo anotação do genoma de Xac: (I) Metabolismo Intermediário; (II) Biossíntese de Pequenas Moléculas; (III) Metabolismo Macromolecular; (IV) Estrutura Celular; (V) Processos Celulares; (VI) Elementos Genéticos de Mobilidade; (VII) Patogenicidade, Virulência e Adaptação; (VIII) Hipotéticas e (IX) ORFs com categorias indefinidas. **Ocorrência refere-se à frequência de indução ou repressão de uma determinada proteína, sendo (IndCu) indução e (RepCu) repressão da proteína em cobre na linhagem 306, (IndA44) indução da proteína na linhagem A44 em relação a linhagem 306 ambas em cobre, (Ind306) indução da proteína na linhagem 306 em relação a linhagem A44 ambas em cobre e a proteína identificada na (Fra09) fração 09 e na (Fra10) fração10 dos ensaios de EMSA.***MM refere-se a massa molecular e pI ao ponto isoelétrico da proteína. Score, refere-se ao programa MASCOT derivado da pesquisa de espectrometria de massas.
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Essa proteína (produto da ORF XAC1517) reguladora da absorção de ferro em Xac contém o motif HHDH (resíduos 86 a 89), o qual foi descrito como sendo essencial para a atividade repressora em P. aeruginosa (LEWIN et al., 2002). Embora não tenhamos conseguido identificar a seqüência consenso para o regulador Fur, GATAATGATAATCATTATC (VALESOVÁ et al., 2013) na região 5'-flanqueadora de copAB, não podemos excluir o gene fur de Xac como um possível regulador da expressão copAB, desde que variações na seqüência consenso também foram descritas (BUTCHER et al., 2011). Além disso, um sítio de ligação alternativo foi descrito para Zur, uma proteína metaloreguladora de detecção Zn2+, também pertencente à família de proteínas Fur (HUANG et al., 2008). A proteína Fur em Xac pode ser importante para a homeostase de cobre e pode participar da proteção ao estresse oxidativo causado pelo metal.
A proteína de ligação a ATP do transportador ABC, produto do gene XAC0741, gi21106859, foi identificada na fração 09 e esse tipo de proteína ligada ao transportador ABC também aparece nas induções por cobre de proteínas em Xac 306 e A44 (dados mostrados na sequência). Esta proteína é um membro de uma grande família de proteínas envolvidas em vários processos celulares, incluindo regulação gênica, reparo de DNA e é primeiramente associada ao sistema de efluxo de substâncias das células. Um elemento desta família identificado na estirpe Xac 306 exposta ao cobre, inclui a proteína Uup, membro da subfamília REG. Curiosamente, E. coli tem um homólogo a Uup com um motif de ligação a DNA em forma de bobina que foi descrito ser capaz de se ligar a várias sequências de DNA de cadeia dupla sem especificidade de sequência (CARLIER et al., 2012). O estresse oxidativo causado pelo cobre induz esses transportadores/reguladores/reparadores especiais que podem participar da detoxificação causada pelo cobre.
A proteína catalase, identificada em ambas as frações ativas, é uma enzima antioxidante pertencente à via de detoxificação. Na linhagem Xac 306, a proteina catalase, codificada pelo gene katE, foi descrita ser controlada por um sistema de dois componentes ColR/ColS que também contribui para a tolerância ao cobre (YAN e WANG, 2011). No entanto, nenhuma proteína relacionada com o sistema de dois componentes foi identificada nos ensaios de EMSA, entretanto essas proteínas apareceram nos sistemas de expressão diferencial em cobre quando as estirpes Xac 306 e A44 foram exposta a 1 mM de CuSO4.5H2O (dados mostrados na sequência).
Essas proteínas podem participar do mecanismo de homeostase de cobre em Xac ou aparecer como resposta ao metal cobre. Análises funcionais adicionais são necessárias para desenharmos um modelo de como essas proteínas interagem entre si, com o cobre e/ou com a região que regulam. Diante desses resultados resolvemos investigar quais proteínas seriam diferencialmente expressas, em presença de cobre, por linhagens de Xac com resistência