As duas linhagens, Xac 306 e Xac A44, foram utilizadas nas análises proteômicas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE), visando elucidar os mecanismos de homeostase e resistência a cobre. As linhagens de Xac 306 e Xac A44 possuem genes cromossomais e plasmidiais de resistência a cobre diferenciados (BEHLAU et al., 2011) que podem codificar proteínas de ligação a cobre diferenciadas. Esses genes podem ser regulados de forma diferente, o que pode refletir em diferentes níveis de expressão, na afinidade de ligação ao cobre e na capacidade de tolerar cobre do meio ambiente.
Para a análise das proteínas induzidas ou reprimidas, as células de Xac 306 e A44 foram crescidas na ausência de cobre durante 15 h, CuSO4.5H2O estéril foi adicionado a uma concentração final de 1 mM e amostras de células foram coletadas antes e após 4 h da adição de cobre. As análises foram realizadas em triplicata e as proteínas diferencialmente expressas, detectadas pelo ImageScanner e analisadas pelo software ImageMaster 2D Platium (GE Healthcare) foram removidas dos géis e digeridas com tripsina. A determinação dos spots foi realizada através da identificação dos peptídeos utilizando o sistema ESI QTOF (LC-MS/MS). Para a identificação peptídica, a pesquisa dos íons MS/MS foi realizada com o programa Mascot Distiller e as pesquisas baseadas em homologia foram realizadas no Banco de Dados XAC052012 do Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), Campinas.
Os perfis proteicos das duas linhagens, Xac 306 e Xac A44, estão apresentados nas Figuras 22 e 23. Na Figura 22 estão apresentados os resultados da expressão diferencial de proteínas da linhagem Xac 306 na ausência e presença de cobre. Para esta linhagem, o perfil proteico de uma maneira geral foi de indução da maioria das proteínas diferencialmente expressas na presença de cobre em relação às células de Xac 306 crescidas sem cobre. Na Figura 23 estão apresentados os resultados comparativos de expressão diferencial de proteínas da linhagem de Xac A44 em relação às células de Xac 306, ambas após 4 h de contato com 1 mM de CuSO4.5H2O. Em relação a esta linhagem, Xac A44, o perfil proteico, de uma maneira geral, foi de repressão da maioria das proteínas diferencialmente expressas na presença de cobre em relação à linhagem Xac 306, entretanto observamos algumas proteínas expressas apenas na linhagem Xac A44.
90
Figura 22- Análise da expressão diferencial de proteínas de Xac 306 na presença de cobre por 2D-PAGE. (A) Células de Xac 306 crescidas na
ausência de cobre por 15 h (controle). (B) Células de Xac 306 coletadas após 4 h de contato com 1 mM de CuSO4.5H2O. Os quadrados indicam
as proteínas reprimidas e as esferas indicam as proteínas induzidas, em relação ao controle. O Peso Molecular (kDa) está indicado ao lado dos géis. A focalização das proteínas foi feita em um gradiente de pH entre 4 a 7. Eletroforese em gel SDS-PAGE 12,5%, corado com Coomassie Brilliant Blue R-250.
91
Figura 23- Análise da expressão diferencial de proteínas de Xac A44 na presença de cobre por 2D-PAGE. (A) Células de Xac 306 coletadas
após 4 h de contato com 1 mM de CuSO4.5H2O (controle). (B) Células de Xac A44 coletadas após 4 h de contato com 1 mM de CuSO4.5H2O. Os
quadrados indicam as proteínas reprimidas e as esferas indicam as proteínas induzidas, em relação ao controle. O peso molecular (kDa) está indicado ao lado dos géis. A focalização das proteínas foi feita em um gradiente de pH entre 4 a 7. Eletroforese em gel SDS-PAGE 12,5%, corado com Coomassie Brilliant Blue R-250.
92
As proteínas de Xac 306 e Xac A44 identificadas por espectrometria de massas estão apresentadas nas Tabelas de 1 a 4 do material suplementar em anexo (Anexo 1). Proteínas diferencialmente expressas da linhagem Xac 306 na presença de cobre estão relatadas nas Tabelas 1 (induzidas em cobre) e 2 (reprimidas em cobre) e as da linhagem Xac A44 em relação à Xac 306, ambas em cobre, estão descritas nas Tabelas 3 (induzidas em cobre na linhagem Xac A44) e 4 (induzidas em cobre na estirpe Xac 306). Diferentes proteínas no mesmo spot foram consideradas quando os valores de massa molecular e pI experimentais encontraram-se condizentes com os dados teóricos das proteínas identificadas. Consideramos como válidos os score acima de 35, que indica identidade ou homologia extensiva da proteína e significância p<0.05. Nessas identificações algumas proteínas apareceram mais de uma vez nos sistemas avaliados, por exempo, a proteína da XAC0834, gi21106962, proteína regulatória do sistema de dois componentes, ColR (Tabelas 1 e 3, em anexo), foi induzida em presença de cobre na linhagem Xac 306 mas com uma indução adicional na linhagem Xac A44 em cobre. Nesse contexto, encontramos outras proteínas em situação similar. O produto da ORF XAC3463 (gi21109824), a proteína TolC, foi reprimido em presença de cobre na linhagem Xac 306 e mostrou uma repressão adicional na linhagem Xac A44 em cobre (Tabelas 2 e 4 do material suplementar em anexo). Outro exemplo é a proteína da XAC3579 (gi21109955), a proteína phosphoglucomutase (XanA), reprimida em cobre na linhagem Xac 306 e com uma repressão adicional na linhagem Xac A44.
As proteínas de Xac 306 e A44 com indução ou repressão elevada em cobre ou com frequência alta nos sistemas avaliados estão relatadas na Tabela 5. Analisando a tabela, encontramos muitas proteínas ligadas a vias de oxi-redução e todas as proteínas citadas na sequência merecem atenção especial quanto as suas possíveis funções regulatórias e/ou responsivas a cobre em Xac, já que apresentaram altos indices de expressão diferencial. Entre elas a proteína alquil hidroperóxido redutase subunit F (gene ahpF), codificada pela ORF XAC0906, a qual foi altamente expressa em cobre na linhagem Xac 306 e relatada como uma proteína de resposta ao estresse oxidativo em E. coli (LING et al., 2012). Essa proteína participa do cluster gênico ahpC-ahpF-oxyR-orfX de resposta a estresse a peróxido em
Xanthomonas (MONGKOLSUK et al., 1997), regulado pelo gene oxyR. Outras proteínas
relatadas como proteínas de resposta ao estresse oxidativo em bacterias são as proteínas aconitase hidratase A e B, das ORFs XAC1882 e XAC1885, induzidas por cobre na estirpe Xac 306. Em Xanthomonas spp. essas enzimas, AcnA e AcnB codificadas por um único locus cromossômico, catalisam a conversão de citrato a isocitrato no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e podem detectar espécies reativas de oxigênio assim como alterações nos níveis celulares de ferro (KIRCHBERG et al., 2012).
93
Tabela 5- Spots, contendo proteínas de Xac 306 ou A44, mostrando indução ou repressão em cobre.
Spot NCBI n° acesso Identidade
Proteica Classe
* Descrição das Proteínas Score Sequencia Cobertura (%)
MM/ pI ***
(teóricos) Ind/RepValor Ocorrência** TipoInd/Rep 2 gi21107041 XAC0906 VII alkyl hydroperoxide reductase subunit F 749 47 57102/ 5,23 117,84 IndCu 2 gi21107084 XAC0946 VIII conserved hypothetical protein 64 5 61847/ 5,39 117,84 IndCu/IndA44 IndCu 4 gi21108034 XAC1831 II imidazole glycerol phosphate dehydratase/histidinol phosphatase bifunctional enzyme (hisB) 747 47 42155/ 5,29 4,96 IndCu
4 gi21108085 XAC1877 VII response regulator (rpfG) 218 22 42401/ 5,36 4,96 IndCu
12 gi21109731 XAC3379 I methanol dehydrogenase regulatory protein 922 40 37675/ 5,60 1,30 IndCu/IndA44 IndCu 19 gi21106962 XAC0834 I two-component system regulatory protein (colR) 396 30 28176/ 6,03 1,33 IndCu/IndA44 IndCu 21 gi21107712 XAC1533 I dihydrolipoamide dehydrogenase 1456 62 50520/ 5,80 1,36 IndCu/Ind306 IndCu 30 gi21107374 XAC1225 V septum site-determining protein 769 59 29022/ 5,22 1,45 IndCu/IndA44 IndCu 32 gi21108032 XAC1829 II histidinol dehydrogenase (hisD) 573 35 44753/ 5,26 1,61 IdnCu/IndA44 IndCu
32 gi21107652 XAC1477 III replicative DNA helicase 226 18 52999/ 5,36 1,61 IndCu
34 gi21110043 XAC3659 I dihydrolipoamide dehydrogenase 915 34 63403/ 5,79 1,83 IndCu/Ind306 IndCu 34 gi21107027 XAC0893 III glutaminyl-tRNA synthetase 203 14 66173/ 5,70 1,83 IndCu/Ind306 IndCu
36 gi21106452 XAC0374 VIII conserved hypothetical protein 315 35 31646/ 5,73 1,46 IndCu
37 gi21108091 XAC1882 VII aconitase hydratase 1092 31 99296/ 5,43 2,29 IndCu
39 gi21107097 XAC0963 III 50S ribosomal protein L10 620 50 18340/ 5,75 1,18 IndCu/Fra09 IndCu
45 gi21110839 XACa0018 V partition protein A 856 62 22398/ 5,17 1,55 IndCu
45 gi21109019 XAC2736 I carboxymethylenebutenolidase 43 10 23904/ 5,31 1,55 IndCu
56 gi21109590 XAC3250 I two-component system regulatory protein (colR) 136 17 25063/ 5,27 1,25 IndCu/Ind306 IndCu 60 gi21108818 XAC2547 II dihydrodipicolinate synthetase 117 10 32032/ 5,70 1,06 IndCu/Ind306 IndCu 61 gi21108641 XAC2389 V ABC transporter ATP-binding protein (uup) 156 9 69725/ 5,22 1,28 IndCu/IndA44/ Fra09 IndCu
3 gi21108795 XAC2528 III heat shock protein G 1149 41 70738/ 5,18 RepCu/IndA44 RepCu
5 gi21109723 XAC3372 I transketolase 1 981 36 72702/ 5,64 1,02 RepCu/Ind306 RepCu
94
Tabela 5- continuição
Spot NCBI n° acesso Identidade
Proteica Classe
* Descrição das Proteínas Score Sequência Cobertura (%)
MM/ pI ***
(teóricos) Ind/RepValor Ocorrência** TipoInd/Rep
6 gi21106230 XAC0174 I phenylalanine hydroxylase 594 43 33503/ 5,06 1,70 RepCu
6 gi21107921 XAC1725 VII survival protein 92 5 27489/ 5,10 1,70 RepCu
10 gi21109955 XAC3579 VII phosphoglucomutase (xanA) 1284 48 49337/ 5,19 1,46 RepCu/Ind306/Fra09 RepCu
10 gi21109824 XAC3463 VII TolC protein 379 23 49575/ 5,59 1,46 RepCu/Ind306 RepCu
17 gi21109574 XAC3236 I succinyl-CoA synthetase beta subunit 841 39 41542/ 4,85 1,22 RepCu/Ind306 RepCu
23 gi21110419 XAC4009 I arginase 743 51 33388/ 5,12 1,53 RepCu/IndA44 RepCu
23 gi21106558 XAC0470 II phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide synthase 107 11 34625/ 5,21 1,53 RepCu/IndA44 RepCu
24 gi21110008 XAC3627 III oligopeptidase A 762 26 75175/ 5,27 1,45 RepCu
25 gi21109653 XAC3309 III aminopeptidase 855 38 48930/ 5,91 1,44 RepCu
25 gi21107713 XAC1534 I dihydrolipoamide S-succinyltransferase 780 36 42297/ 5,87 1,44 RepCu/Ind306 RepCu
25 gi21108597 XAC2348 II acetylglutamate kinase 45 5 49520/ 5,73 1,44 RepCu/Ind306 RepCu
26 gi21108543 XAC2298 III 30S ribosomal protein S1 1776 55 61701/ 5,05 1,43 RepCu/IndA44 RepCu 26 gi21110045 XAC3661 I dihydrolipoamide acetyltranferase 578 28 60410/ 5,18 1,43 RepCu/IndA44 RepCu 33 gi21108267 XAC2041 I phosphoenolpyruvate synthase 1199 41 86124/ 5,12 1,65 RepCu/IndA44 RepCu
41 gi21107915 XAC1719 I enolase 933 36 45992/ 4,96 1,18 RepCu/IndA44 RepCu
42 gi21110489 XAC4074 II ribonucleoside-diphosphate reductase beta chain 879 38 39496/ 4,96 1,58 RepCu 53 gi21107092 XAC0957 III elongation factor Tu 391 24 43344/ 5,45 1,30 RepCu/IndA44/Fra09 RepCu 53 gi21106040 XAC0002 III DNA polymerase III beta chain 103 7 40842/ 5,35 1,30 RepCu/IndA44 RepCu
63 gi21107591 XAC1421 III elongation factor Ts 1132 58 31085/ 5,23 1,12 RepCu/IndA44 RepCu
F122 gi21109007 XAC2725 II chorismate synthase (AroC) 107 7 39343/ 6,02 1,16 IndA44/Fra09 IndA44 F138 gi21109692 XAC3344 I fructose-bisphosphate aldolase 1294 66 36538/ 4,98 1,15 IndA44/Fra09/ Fra10 IndA44 F161 gi21107374 XAC1225 V septum site-determining protein 1175 80 29022/ 5,22 1,10 IndCu/IndA44 IndA44
95
Tabela 5- continuição
Spot NCBI n° acesso Identidade
Proteica Classe
* Descrição das Proteínas Score Sequência Cobertura (%)
MM/ pI ***
(teóricos) Ind/RepValor Ocorrência** TipoInd/Rep F171 gi21106962 XAC0834 I two-component system regulatory protein (colR) 728 45 28176/ 6,03 1,04 IndCu/IndA44 IndA44 F171 gi21109279 XAC2971 V ABC transporter ATP-binding protein (yhbG) 145 20 26372/ 5,59 1,04 IndCu/IndA44/ Fra09 IndA44
F197 gi313585031 ADR70750 VI transposase 300 40 17939/ 6,11 8,04 IndA44
F197 gi21107630 XAC1457 VII glutathione peroxidase-like protein 189 43 18197/ 5,91 8,04 IndA44
F44 gi21107912 XAC1716 I CTP synthetase 699 32 61729/ 5,91 52,25 IndA44
F44 gi21108813 XAC2543 VIII conserved hypothetical protein 52 4 67152/ 5,75 52,25 IndA44
F52 gi21108795 XAC2528 III heat shock protein G 1460 48 70738/ 5,18 24,11 RepCu/IndA44 IndA44
F91 gi21106906 XAC0784 V cell division protein (FtsZ) 1075 66 42851/ 4,82 2,52 IndA44
F91 gi21106058 XAC0019 IV outer membrane protein (ompP1) 519 28 47272/ 5,18 2,52 IndA44
N13 gi21106733 XAC0628 III prolyl oligopeptidase 323 9 77194/ 6,31 2,28 IndA44
N18 gi21110045 XAC3661 I dihydrolipoamide acetyltranferase 71 3 60410/ 5,18 89,35 RepCu/IndA44 IndA44 N23 gi21107084 XAC0946 VIII conserved hypothetical protein 152 9 61847/ 5,39 2,50 IndCu/IndA44 IndA44
N23 gi21108186 XAC1967 I transcriptional regulator (fleQ) 71 4 54394/ 5,37 2,50 IndA44
N25 gi21109527 XAC3194 IV outer membrane receptor for transport of vitamin B (TonB-dependent ) 130 4 67646/ 5,35 2,34 IndA44 N26 gi21108543 XAC2298 III 30S ribosomal protein S1 247 13 61701/ 5,05 4,61 RepCu/IndA44 IndA44
N28 gi77748661 XAC2537 III peptidase 34 5 55277/ 5,21 9,05 IndA44
N31 gi21108032 XAC1829 II histidinol dehydrogenase (hisD) 206 12 44753/ 5,26 7,25 IndCu/IndA44 IndA44
N31 gi21108629 XAC2378 VIII conserved hypothetical protein 85 3 48840/ 5,19 7,25 IndA44
N32 gi21107217 XAC1077 III peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (ATP-independent chaperone) 295 16 48216/ 5,19 2,16 IndA44/Fra09 IndA44
N32 gi21110032 XAC3649 I ATP synthase beta chain 150 9 50979/ 5,18 2,16 IndA44
N32 gi21110816 XAC4370 VII thiophene and furan oxidation protein 106 4 47686/ 5,42 2,16 IndA44 N35 gi21107092 XAC0957 III elongation factor Tu 240 14 43344/ 5,45 55,38 RepCu/IndA44/Fra09 IndA44
96
Tabela 5- continuição
Spot NCBI n° acesso Identidade
Proteica Classe
* Descrição das Proteínas Score Sequência Cobertura (%)
MM/ pI ***
(teóricos) Ind/RepValor Ocorrência** TipoInd/Rep
N36 gi21107915 XAC1719 I enolase 184 10 45992/ 4,96 1,33 RepCu/IndA44 IndA44
N38 gi21106040 XAC0002 III DNA polymerase III beta chain 61 4 40842/ 5,35 1,44 RepCu/IndA44 IndA44
N39 gi21110395 XAC3987 III leucine aminopeptidase 54 2 49577/ 5,90 14,93 IndA44
N40 gi21107471 XAC1313 I acyl-CoA dehydrogenase 79 7 42537/ 6,17 1,61 IndA44/Fra09 IndA44
N43 gi21107036 XAC0902 I transaldolase B 189 10 34836/ 5,12 128,14 IndA44
N44 gi21109731 XAC3379 I methanol dehydrogenase regulatory protein 90 4 37675/ 5,60 1,32 IndCu/IndA44 IndA44 N45 gi21107591 XAC1421 III elongation factor Ts 512 25 31085/ 5,23 1,27 RepCu/IndA44 IndA44
N46 gi21106356 XAC0288 I oxidoreductase (mocA) 231 10 34737/ 5,07 2,14 IndA44
N46 gi21110657 XAC4223 VIII conserved hypothetical protein 46 2 33492/ 5,15 2,14 IndA44
N46 gi21109816 XAC3456 II 3-isopropylmalate dehydrogenase 44 6 38289/ 5,27 2,14 IndA44
N47 gi21107606 XAC1435 V iron receptor (FhuA TonB dependent) 181 5 78941/ 5,60 3,13 IndA44 N47 gi21107142 XAC1004 V GTP-binding elongation factor protein 89 3 67406/ 5,30 3,13 IndA44 N48 gi21106583 XAC0495 I two-component system regulatory protein (REC e EAL) 121 6 63329/ 5,06 2,87 IndA44
N51 gi21109008 XAC2726 III glutamine-specific methylase 108 5 33917/ 4,70 21,49 IndA44
V134 gi21110419 XAC4009 I Arginase 162 9 33388/ 5,12 1,02 RepCu/IndA44 IndA44
V139 gi21106558 XAC0470 II phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide synthase 100 7 34625/ 5,21 1,05 RepCu/IndA44 IndA44 V19 gi21108267 XAC2041 I phosphoenolpyruvate synthase 254 7 86124/ 5,12 1,11 RepCu/IndA44 IndA44
V71 gi21110414 XAC4004 III peptidase 142 6 57739/ 5,77 1,73 IndA44
V79 gi21106528 XAC0443 I dihydrolipoamide acyltransferase 204 12 51862/ 5,70 1,12 IndA44/Fra09 IndA44
V88 gi21106170 XAC0120 III TldD protein 273 11 48782/ 6,00 1,96 IndA44
F107 gi21106799 XAC0687 VIII conserved hypothetical protein 528 36 45796/ 4,83 1,45 Ind306
F108 gi21109574 XAC3236 I succinyl-CoA synthetase beta subunit 776 38 41542/ 4,85 1,01 RepCu/Ind306 Ind306
97
Tabela 5- continuição
Spot NCBI n° acesso Identidade
Proteica Classe
* Descrição das Proteínas Score Sequência Cobertura (%)
MM/ pI ***
(teóricos) Ind/RepValor Ocorrência** TipoInd/Rep F153 gi21108536 XAC2292 I UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase 825 53 32253/ 5,45 1,45 Ind306
F163 gi21109651 XAC3307 I fumarylacetoacetate hydrolase 138 10 25269/ 5,61 2,22 Ind306
F163 gi21109544 XAC3209 VII trehalose-6-phosphate phosphatase 98 7 27070/ 5,60 2,22 Ind306/Fra10 Ind306 F164 gi21108818 XAC2547 II dihydrodipicolinate synthetase 1142 55 32032/ 5,70 3,03 IndCu/Ind306 Ind306 F172 gi21109590 XAC3250 I two-component system regulatory protein (colR) 792 58 25063/ 5,27 1,54 IndCu/Ind306 Ind306
F172 gi21108544 XAC2299 II cytidylate kinase 304 37 24138/ 5,34 1,54 Ind306/Fra09 Ind306
F179 gi21108638 XAC2386 VII superoxide dismutase 387 48 22703/ 5,47 1,58 Ind306
F188 gi21110115 XAC3725 VIII conserved hypothetical protein 662 50 18344/ 5,03 1,54 Ind306/Fra09/ Fra10 Ind306 F188 gi21107496 XAC1335 II hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 90 9 20278/ 5,14 1,54 Ind306
F200 gi21106252 XAC0193 VIII conserved hypothetical protein 231 36 17603/ 5,35 2,25 Ind306
F200 gi21109624 XAC3281 VIII conserved hypothetical protein 71 22 17425/ 5,33 2,25 Ind306
F41 gi21110607 XAC4179 II acetyl coenzyme A synthetase 1294 45 71688/ 5,67 1,15 RepCu/Ind306 Ind306
F41 gi21109723 XAC3372 I transketolase 1 261 10 72702/ 5,64 1,15 RepCu/Ind306 Ind306
F50 gi21110043 XAC3659 I dihydrolipoamide dehydrogenase 1124 37 63403/ 5,79 1,18 IndCu/Ind306 Ind306 F50 gi21107027 XAC0893 III glutaminyl-tRNA synthetase 531 34 66173/ 5,70 1,18 IndCu/Ind306 Ind306 F6 gi21108094 XAC1885 I bifunctional aconitate hydratase 2 558 16 93473/ 5,22 14,14 Ind306 F64 gi21109956 XAC3580 VII phosphomannose isomerase (xanB) 1062 47 51043/ 5,57 1,20 Ind306/Fra09 Ind306
F65 gi21106928 XAC0804 I adenosylhomocysteinase 1056 47 53165/ 5,51 1,98 Ind306
F65 gi21107823 XAC1635 I urocanate hydratase 166 11 60481/ 5,47 1,98 Ind306
F81 gi21107712 XAC1533 I dihydrolipoamide dehydrogenase 1230 51 50520/ 5,80 1,04 IndCu/Ind306 Ind306 F85 gi21107713 XAC1534 I dihydrolipoamide S-succinyltransferase 1477 55 42297/ 5,87 1,28 RepCu/Ind306 Ind306 F85 gi21108597 XAC2348 II acetylglutamate kinase 293 14 49520/ 5,73 1,28 RepCu/Ind306 Ind306 F98 gi21109955 XAC3579 VII phosphoglucomutase (xanA) 961 53 49337/ 5,19 1,34 RepCu/Ind306/Fra09 Ind306
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Tabela 5- continuição
*Classes proteicas segundo anotação do genoma de Xac: (I) Metabolismo Intermediário; (II) Biossíntese de Pequenas Moléculas; (III) Metabolismo Macromolecular; (IV) Estrutura Celular; (V) Processos Celulares; (VI) Elementos Genéticos de Mobilidade; (VII) Patogenicidade, Virulência e Adaptação; (VIII) Hipotéticas e (IX) ORFs com categorias indefinidas. **Ocorrência refere-se à frequência de indução ou repressão de uma proteína, sendo (IndCu) indução e (RepCu) repressão da proteína em cobre na linhagem 306, (IndA44) indução da proteína na linhagem A44 em relação a linhagem 306 ambas em cobre, (Ind306) indução da proteína na linhagem 306 em relação a linhagem A44, ambas em cobre e à proteína identificada na (Fra09)
fração 09 e na (Fra10) fração10 dos ensaios de EMSA.***MM refere-se a massa molecular e pI
ao ponto isoelétrico da proteína. Score, refere-se ao programa MASCOT derivado da pesquisa de espectrometria de massas. Em negrito estão salientadas as proteínas de spots com alto índice de indução em cobre.
Outra proteína induzida por cobre na linhagem Xac 306, o regulador de resposta rpfG, codificado pela ORF XAC1877, com sítios de ligação a Mg+2 e Zn+2 pertence ao sistema de dois componentes RpfC/RpfG. Esse sistema regula o locus gênico xagABC em X. campestres, o qual foi relatado codificar um sistema de transferase de glicosil, que interfere na produção de polissacarídeos extracelulares, na formação de biofilme e na resistência bacteriana ao estresse oxidativo (TAO; SWARUP; ZHANG, 2010).
Com relação à linhagem Xac A44, podemos citar como proteínas interessantes, induzidas em presença de cobre, a proteína glutationa peroxidase, codificada pela ORF XAC1457 e descrita como de proteção ao estresse oxidativo causado por metais e compostos orgânicos em bactérias (POTTER; TRAPPETTI; PATON, 2012) e a proteína transposase, produto da ORF ADR70750, pertencente ao operon plasmidial copLABMGCDF de Xac A44 (BELHAU et al., 2011). Essa proteína pertence exclusivamente ao sistema de resistência a cobre em Xac e a esse operon é atribuído as elevadas taxas de sobrevivência em cobre dessa linhagem.
A família das chaperonas HSP90 (proteína de choque térmico) é altamente conservada e expressa em vários organismos desde procariotos aos eucariotos. Proteínas HSP90 desempenham funções de manutenção essenciais, tais como o controle de atividade, rotatividade e tráfico de várias proteínas, promovendo a sobrevivência celular através da manutenção da integridade estrutural e funcional de algumas proteínas nascentes, que controlam a sobrevivência celular, a proliferação e apoptose. Proteínas chaperonas HSP90 são dependentes de ATP e a ligação e hidrólise do ATP são acopladas a alterações conformacionais em HSP90, que facilitam a modelagem e maturação das proteínas nascentes. Uma dessas proteínas HSP90 (proteína de choque térmico G) foi altamente induzida em cobre na linhagem Xac A44, codificada pela ORF XAC2528, possuindo sítios de ligação ao metal Mg+2. Essa proteína em X. albilineans foi demostrada ser importante para a biossíntese da fitotoxina albicidina (VIVIEN et al., 2005) e em Xac pode ser importante para síntese de outras fitotoxinas ou proteínas em resposta ao cobre.
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Outra proteína, a CTP sintase (gene pyrG), que catalisa a conversão de UTP em CTP por aminação dependente de ATP a partir de L-glutamina ou amônia como fontes de nitrogênio, foi altamente induzida por cobre em Xac A44. Essa conversão é um passo essencial na via metabólica de pirimidina de uma variedade de bactérias e em E. coli, a CTP sintase, existe na forma um tetrâmero com resposta ao estresse causado por óxidos heterocíclicos (GUO et al., 2012).
A proteína dihidrolipoamida acetiltranferase (gene phdB), codificada pela ORF XAC3661, também foi altamente induzida por cobre em Xac A44. Essa enzima catalisa a transferência do grupo acetil da dihidrolipoamida acetil para a coenzima A formando acetil-CoA, foi descrita como regulada por íons ferro em P. aeruginosa (WANG et al., 2008). No genoma de
Xac esta enzima (produto do gene phdB) está proximamente localizada à proteína
dihidrolipoamida desidrogenase (gene lpdA), ORF XAC3659, proteína também relatada como de ligação a metal (SIEGMANN et al., 2009) e que aparece nas induções por cobre na linhagem Xac 306. Esses genes em Xac podem ser especificamente regulados por cobre e esse fato deve ser investigado em estudos futuros.
A proteína codificada pela ORF XAC0902, a transaldolase B, uma enzima pertencente as aldolases da classe I que desempenham um papel importante no metabolismo, incluindo a manutenção do equilíbrio de metabólitos na via das pentoses-fosfato, foi altamente induzida quando a linhagem Xac A44 foi exposta a 1 mM de CuSO4. Este tipo de enzima foi descrita recentemente ser induzida por Hg+2 em E. coli (GAO et al., 2013) e está localizada no mesmo cluster gênico que contém o regulador transcricional de estresse oxidativo (gene oxyR, XAC0905) e a proteína alquil hidroperóxido redutase subunit F, XAC0906, induzida em cobre na linhagem Xac 306. Esse cluster gênico merece atenção especial na detoxificação de espécies reativas de oxigênio geradas por cobre em Xac.
Outra proteína a metiltransferase dependente de S-adenosilmetionina (AdoMet-MTase, gene yfcB) envolvida na metilação da proteína ribossomal L3 foi induzida em Xac A44 em presença de cobre, codificada pela XAC2726. AdoMet-MTases são enzimas que utilizam S- adenosil-L-metionina (SAM ou AdoMet) como um substrato para transferir metil, criando o produto S-adenosil-L-homocisteína (AdoHcy). Há pelo menos cinco famílias estruturalmente distintas de AdoMet-MTases, sendo a classe I a maior e a mais diversificada. Esta classe de enzimas podem ser classificadas em diferentes especificidades de substrato (proteínas, lipídos, ácidos nucléicos, etc) e diferentes átomos alvo para a metilação (nitrogênio, oxigênio, carbono, enxofre, etc.). O significado biológico da metilação de proteínas ribossomais (PR) e fatores de tradução (FT) é pouco compreendido e deleções nos genes de MTases normalmente não causam alterações fenotípicas. Aparentemente a metilação modula interações intra ou intermolecular das proteínas alvo ou afeta a sua afinidade com o RNA, e, assim, influencia vários processos celulares, incluindo a regulação da transcrição, processamento de RNA, a
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montagem do ribossomo, a precisão da tradução, o tráfico nuclear, o metabolismo de proteínas e a sinalização celular. Metilação diferencial de proteínas ribossomais e fatores de tradução específicos em um número de organismos, em diferentes estados fisiológicos, têm indicado que esta modificação pode desempenhar uma função regulatória (POLEVODA e SHERMAN, 2007). Em Xac A44, em presença de cobre, a função dessa proteína deve ser investigada.
A fase de elongação da tradução é promovida por três fatores de elongação universais, FE-Tu, FE-Ts, e FE-G em bactérias e seus homólogos em archaea e eucariotos. Descobertas recentes demonstraram que a tradução de um subconjunto de RNAm requer um quarto fator de elongação, o FE-P em bactérias ou os fatores homólogos a eIF5A em outros organismos. FE-P impede o ribossomo trave durante a síntese de proteínas que contenham resíduos de prolina consecutivos, tais como PPG, PPP, ou aglomerados com mais prolina. A síntese eficiente e coordenada de tais proteínas é necessária para o crescimento bacteriano, motilidade, virulência e resposta ao estresse (DOERFEL e RODNINA, 2013). O fator de elongação Tu foi altamente induzido em cobre na linhagem Xac A44 mas reprimido na linhagem Xac 306 em cobre. Esse fator de elongação Tu em conjunto com as chaperonas HSP33 tem sido asssociado à resistência ao estresse oxidativo (WHOLEY e JAKOB, 2012) e reportado como responsivo a metais em P. fluorescens (SHARMA et al., 2006), portanto merece ser avaliado em detalhes em estudos futuros.
A proteína leucina aminopeptidase (LAP) é descrita como uma proteína induzida por ions metálicos divalentes e por ser essencial para a sobrevivência de bactérias como S. aureus (SINGH et al., 2012). Em tomateiros essa enzima extracelular é induzida por tratamento da planta com metais (BOULILA-ZOGHLAMI et al., 2011). A enzima leucina aminopeptidase, produto da ORF XAC3987 foi induzida em cobre na linhagem Xac A44, assim como outra proteína, a histidinol desidrogenase (gene hisD), codificada pela ORF XAC1829, relatada como dependente de metal e essencial para a sobrevivência de M. tuberculosis (NUNES et al., 2011). Estas enzimas podem ter uma importância diferenciada na sobrevivência da linhagem
Xac A44 em cobre.
Algumas proteínas, com induções menores em cobre, possuem funções variáveis.