Análise de frações protéicas de Heparina-Sepharose por eletroforese bidimensional

Frações cromatográficas obtidas em Heparina-Sepharose tiveram suas proteínas identificadas por análises de 2-DE. Para essas análises as frações protéicas, contendo 600 µg de proteína total, foram tratadas por duas vezes com o kit 2D Clean-Up (GE Healthcare), conforme orientações do fabricante, ressuspensas em tampão de amostra (Tris 30 mM, pH 8,0, uréia 7,0 M, thioréia 2,0 M, CHAPS 4% e traços de azul de bromofenol) e quantificadas pelo Kit 2-D Quant Kit (GE Healthcare).

As proteínas foram, primeiramente, submetidas à focalização isoelétrica em um sistema IPGphor3TM _{system (GE Healthcare). Para isso, uma quantidade de 200 µg de proteínas em} tampão de reidratação (7 M de ureia, 2 M thiorea, CHAPS 4% v/v, 30 mM de Tris-HCl, traços de azul de bromofenol e 20 mM DTT) com 0,5% IPG buffer v/v (GE Healthcare) e 50 µL de solução de reidratação DeStreak  (GE Healthcare), em um volume final de 250 µL, foram aplicadas sob tiras de gel imobilizado IPG (Immobiline DryStrip, GE Healthcare). Foram

utilizadas tiras de 13 cm com gradientes de pH de 4 a 7. As tiras foram colocadas em um suporte próprio e reidratadas por 24 h a 20ºC.

A focalização isoelétrica foi conduzida a 50 µA/tira a 20°C no sistema Ettan IPGphor3 (GE Healthcare), usando-se as seguintes etapas: 100 V (10 h), 500 V (500 Vh), 1000 V (750 Vh), 8000 V (11.325 Vh), 8000 V (5067 Vh ) e 100 V (10 h). Após a focalização isoelétrica, as tiras de IPG foram reduzidas durante 15 min em 3 mL de tampão de equilíbrio [50 mM de Tris- HCl (pH 8,8), 6 M de ureia, 30% de glicerol v/v, 2% de SDS w/v, traços de azul de bromofenol e 10 mg/mL DTT]. A alquilação também foi realizada durante 15 min no mesmo tampão contendo 25 mg/mL iodoacetamida (IAA), ao invés de DTT.

Amostras de proteína foram separadas em uma segunda dimensão em gel de poliacrilamida 12,5% (SDS-PAGE) a 10 mA/gel durante 30 min e 45 mA/gel usando um sistema

de HoeferTM_{SE600 (GE Healthcare), em tampão 1X Tris-Glicina (10X: Tris 250 mM, pH 8,0,}

glicina 1,92 M e SDS 1%). Para isso, as tiras previamente equilibradas foram colocadas sobre os géis de poliacrilamida e seladas com agarose 0,5% em tampão 1X Tris-Glicina com traços de azul de bromofenol. Após eletroforese, os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250, as proteínas detectadas pelo Image Scanner e analisadas pelo software Image Master 2D Platinum (GE Healthcare).

7.1. Análise de imagens de 2-DE das frações cromatográficas

As imagens dos géis de 2-DE foram adquiridas usando-se o ImageScanner (GE Healthcare). Os valores de intensidade de coloração (% do volume), de peso molecular e ponto isoelétrico foram estimados para cada spot protéico utilizando-se o ImageMaster 2D Platinum 6,0 software (GE Healthcare). A porcentagem de volume de cada spot foi calculada pelo software ImageMaster considerando 100% do volume total de toda a imagem do gel. Todas as proteínas reveladas em gel de poliacrilamida foram selecionadas para as análises de espectrometria de massa.

7.2. Digestão protéica, análises de espectrometria de massa e busca em banco de dados

A identificação dos spots de 2-DE foi realizada através da identificação dos peptídeos utilizando um sistema de ultra performance nanoAcquilty acoplado a um espectrômetro de massa ESI QTOF ULTIMA API - Waters (LC-MS/MS) após o tratamento do gel com tripsina. Os spots foram retirados do gel manualmente com uma ponteira e lavados por duas vezes com 500 μL de metanol 50% e ácido acético 2,5%, durante 2 h, para a descoloração e remoção do SDS. Em seguida, foram desidratados com 200 μL de acetonitrila 100% (ACN) e secos a vácuo após a remoção da ACN. As proteínas nos spots foram reduzidas pela adição de 30 μL de

ditiotreitol 10 mM em NH4HCO3 100 mM e incubadas durante 30 min, seguida de alquilação com 30 μL de iodoacetamida 50 mM em NH4HCO3 100 mM durante 30 min no escuro. Em seguida, os spots do gel foram submetidos a lavagem e etapas consecutivas de desidratação com 200 μL de NH4HCO3 100 mM e 200 μL de ACN 100%, respectivamente, e secagem a

vácuo. Os géis secos foram rehidratados com 20 μL de tripsina (20 ng. mL-1_{em NH4HCO3 50}

mM, Promega) e incubados em gelo durante 30 min. O excesso de tripsina foi removido e os spots cobertos com 20 μL de NH4HCO3 50 mM. A digestão foi realizada durante a noite a 37°C. Os peptídeos trípticos foram extraídos (i) por adição de 10 μL de ácido fórmico 5%, incubação durante 10 min à temperatura ambiente e a solução transferida para um novo tubo, e (ii) por adição de 12 μL de ácido fórmico 5% e ACN 50%, incubados durante 10 min à temperatura ambiente. Ambas as frações foram combinadas e concentradas sob vácuo para um volume final de 1 μL. Cada amostra foi ressuspensa em 10 μL de ácido fórmico 0,1% e 4,5 μL injetados para separação cromatográfica em uma coluna analítica C18 RP-UPLC (1,7 μm BEH 130 C18, 100 μm x 100 mm, nanoACQUITY UPLC, Waters) acoplada em tandem a um nano eletrospray e a um espectrômetro de massa Q-TOF Ultima API (Micromass/Waters) a um fluxo de 0,6 μL. min-1_{. O gradiente utilizado foi de 15-90% ACN em ácido fórmico 0,1% durante 10 min. A} desalinização da amostra foi realizada utilizando uma coluna C18 Symmetry (180 μm x 20 mm)

a uma taxa de fluxo de 5 μL. min-1_{ao longo de 1 min. O equipamento foi operado em modo}

positivo de MS, a aquisição de dados contínua a partir de m/z 100-2000 Da, a uma taxa de varredura de 1 s e um atraso intervarredura de 0,1 s. Para a identificação de peptídeos, a pesquisa dos íons MS/MS foi realizada com Mascot Distiller (versão 2.3.2.0, 2009, Matrix Science, Boston, MA), utilizando as seguintes restrições: (i) tripsina como digestão enzimática, (ii) a oxidação da metionina como modificações variáveis, (iii) carbamidometilação de cisteína como modificações fixas, (iv) os valores de massa foram considerados monoisotópicos, (v) a massa de proteína foi irrestrita, (vi) a tolerância a massa do peptídeo foi de 0,1 Da, (vii) a tolerância de massa do fragmento foi de 0,1 Da, (viii) clivagens máximas perdidas igual a 1, (ix) significância de p < 0,05. As pesquisas baseadas em homologia foram realizadas com o Banco de Dados XAC052012 coletado do NCBI (com 187.047 sequências e 60.106.417 resíduos) no Laboratório Nacional de Biociências, Campinas, para a identificação de proteínas de Xac.

8. Análise de proteínas diferencialmente expressas por eletroforese bidimensional (2D- PAGE)

Duas linhagens, Xac 306 e Xac A44, foram utilizadas nas análises proteômicas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) visando elucidarmos os mecanismos de resistência a cobre.

8.1. Extração e preparação das proteínas totais

A análise de proteínas induzidas ou reprimidas nas células crescidas na presença de cobre foi realizada por eletroforese bidimensional. Para esta análise as células foram crescidas em meio Nutriente tamponado na ausência de cobre durante 15 h (28°C, 170 rpm). Em seguida, solução de CuSO4.5H2O estéril foi adicionada para uma concentração final de 1 mM e amostras foram removidas antes e após 4 h a adição de cobre. As células foram coletadas, lavadas 2 vezes em tampão fosfato pH 7,2, contendo NaCl 150 mM e utilizadas para a extração de proteínas totais, conforme método descrito por MEHTA e ROSATO (2001). Para isso, as células foram ressuspensas em tampão de extração contendo Tris-HCl 0,5 M, pH 8,0, 0,7 M de sacarose, HCl 30 mM, EDTA 50 mM, KCl 0,1 M e DTT 40 mM e incubadas à temperatura ambiente por 15 min. A seguir, o mesmo volume de fenol (saturado com Tris 10 mM e EDTA 1 mM, pH 8,0) foi adicionado e a mistura foi agitada por 15 min em vortex. A mistura foi centrifugada a 12.000 x g, em centrífuga de bancada, por 5 min e o sobrenadante (fase fenólica) foi recuperado. Este procedimento foi repetido mais duas vezes. No final desta etapa, as proteínas foram precipitadas pela adição de 5 volumes de acetato de amônio 0,1 M em metanol durante 4 h a –20ºC. As proteínas foram coletadas a 12.000 x g, durante 5 min, a 4ºC. A seguir, o precipitado foi lavado duas vezes com 1 mL de uma solução de acetato de amônio 0,1 M em metanol e quatro vezes com 1mL de acetona 80% gelada. O precipitado foi seco e solubilizado em 100 µL de tampão de amostra (Tris 30 mM, pH 8,0, uréia 7,0 M, tioréia 2,0 M, CHAPS 4% e traços de azul de bromofenol). As proteínas foram tratadas com o kit 2D Clean-Up (GE Healthcare), conforme indicações do fabricante, por duas vezes, ressuspensas em tampão de amostra e quantificadas pelo Kit 2-D Quant Kit (GE Healthcare).

8.2. Ensaio de 2D-PAGE

Esse ensaio foi realizado primeiramente com a focalização isoelétrica no sistema IPGphor3TM_{system (GE Healthcare) com 250 µg de proteínas totais conforme descrito no item 7} dessa seção. Amostras de proteína foram separadas em uma segunda dimensão em gel de poliacrilamida 12,5% (SDS-PAGE) a 10 mA/gel durante 30 min e 45 mA/gel usando um sistema

de HoeferTM_{SE600 (GE Healthcare), em tampão 1X Tris-Glicina (10X: Tris 250 mM, pH 8,0,}

glicina 1,92 M e SDS 1%). Para isso, as tiras previamente equilibradas foram colocadas sobre os géis de poliacrilamida e seladas com agarose 0,5% em tampão 1X Tris-Glicina com traços de azul de bromofenol. Após eletroforese, os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250 e as proteínas diferencialmente expressas detectadas pelo Image Scanner e analisadas pelo software Image Master 2D Platinum (GE Healthcare). As análises de cada linhagem, Xac 306 e Xac A44, foram realizadas em triplicata para as condições de ausência e presença de cobre.

8.3. Análise de imagens de 2-DE e comparação entre géis com proteínas diferencialmente expressas em cobre

As imagens de géis de 2-DE foram adquiridas com o ImageScanner (GE Healthcare). Os valores de intensidade de coloração dos spots (% do volume), peso molecular e ponto isoelétrico foram estimados para cada spot protéico utilizando-se o ImageMaster 2D Platinum 6,0 software (GE Healthcare). A porcentagem de volume de cada spot foi calculada pelo software ImageMaster considerando 100% do volume total de toda a imagem do gel. Diagramas de dispersão (%volume vs %volume) nos locais de correspondência foram obtidos para avaliação do grau de reprodutibilidade entre as triplicatas de cada experimento (entre as estirpes controle sem exposição ao cobre e as estirpes expostas ao metal). Os valores de correlação superiores a 0,9 foram considerados significativos para as análises. Apenas os spots típicos presentes em todas as réplicas foram selecionados para a análise de correspondência. O matching foi realizado entre as proteínas totais da estirpe controle e da estirpe após 4 h de exposição ao metal, ou entre a estirpe sensível e resistente ao cobre após 4 h de exposição. As proteínas expressas ou reprimidas após a exposição ao metal foram selecionadas para análise de espectrometria de massa apenas se a variação entre ensaios foi estatisticamente significativa (teste t-Student, com nível de confiança de 0,05 ou menor), conforme determinado pelo software.

8.4. Digestão protéica, análises de espectrometria de massa e busca em banco de dados

9. Análise da expressão proteica de CopA e CopB por Western blot

Na análise da expressão proteica de CopA e CopB por Western blot, as células de Xac selvagens, A44 (resistente a cobre), 306 (controle) e mutantes XAC3629::Tn foram crescidas na ausência e presença de 1 mM de CuSO4.5H2O e as proteínas totais extraídas como descrito item 8.1. Nessa avaliação as proteínas quantificadas (40 μg para CopA e 80 μg por CopB) foram fracionadas por eletroforese em SDS-PAGE 9% (para CopA) ou 12% (para CopB). A eletroforese foi realizada à temperatura ambiente, com uma diferença de potencial de 100 V no sistema de eletroforese Mini-Protean II (Bio-Rad).

9.1. Ensaio de Western blot

O extrato total protéico de Xac, após fracionamento por eletroforese, foi transferido para uma membrana de nitrocelulose, em tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, glicina 150 mM e metanol 20%, a 100 V durante 4 h, utilizando o sistema TransBlot (Bio-Rad). Após a transferência, as membranas foram bloqueadas com 20 mL de 8% leite em pó desnatado em TBST (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, Tween-20 0,05%) durante a noite. Posteriormente, as membranas foram lavadas com TBST por 3 vezes e incubadas com o anticorpo primário (anti-CopA ou anti-CopB, diluição 1: 500) em TBST contendo 3% leite durante 2 h, lavadas com TBST 3 vezes, 5 min cada lavagem, e incubadas novamente por 2 h com anticorpo secundário anti-IgG conjugado com peroxidase (Sigma, diluição 1: 15.000). Em seguida, as membranas foram novamente lavadas com TBST por 3 vezes e procedeu-se a revelação incubando as membranas durante 1 min e 30 s com 5 mL de uma solução tampão Tris-HCl 100 mM, pH 8,5, contendo ácido p-cumárico 0,2 mM e luminol 1,25 mM e 1,5 µL de peróxido de hidrogênio 30% (v/v). Em seguida, as membranas foram expostas ao filme radiográfico Kodak T-Mat G/RA por 15 s, à temperatura ambiente.

No documento Caracterização molecular de proetínas envolvidas nos mecanismos de homeostase de cobre em Xanthomonas citri subsp. citri (páginas 51-56)