ANÁLISE DE NNP E PROTEÍNA VERDADEIRA PELO MÉTODO DE

VERDADEIRA PELO MÉTODO DE KJELDAHL

A quantificação de NNP das amostras representativas de tanques de refrigeração de propriedades rurais foi realizada em conformidade com a norma International IDF Standard 20B:1993 (IDF, 1993). Empregou-se o método Kjeldahl que emprega bloco de digestão, parte 4 da referida norma analítica. Todos os reagentes empregados foram de grau analítico (P.A.) e a balança analítica empregada encontrava-se calibrada com certificado emitido

pela Rede Brasileira de Calibração (RBC) e a água empregada era deionizada e destilada. Em conformidade com a norma NBR ISO 17025, para fins de rastreamento, foram registradas as informações quanto ao preparo e aos insumos empregados no preparo de soluções que atuaram como reagentes e como soluções volumétricas (ABNT, 2005).

Seqüencialmente à pesagem do leite para determinação da PB, uma alíquota correspondente a 20 mL de amostra foi analitica e exatamente pesada sobre um Erlenmeyer e adicionada de 80 mL de solução de ácido tricloroacético 12% m/v também analitica e exatamente pesados. Procedeu-se agitação manual leve com movimentos circulares, e aguardou-se no mínimo 5 minutos para precipitação das proteínas. Todo o conteúdo do Erlenmeyer foi vertido para um funil de vidro contendo um papel de filtro qualitativo Nalgon®, e realizada a filtração completa. O filtrado foi recolhido em frasco de vidro e devidamente vedado com tampa de encaixe sob pressão. As amostras foram congeladas em temperatura de -18° a -15° C. A transparência e limpidez do filtrado amarelo claro foram sempre observadas, como forma de controle da eficiência do processo de retenção pelo papel de filtro das proteínas das amostras. De 15 amostras coletadas no mês de agosto, os procedimentos de obtenção do filtrado foram realizados em duplicata, objetivando realização de experimento paralelo de estabilidade das amostras congeladas, analisando-se o teor em NNP no dia de obtenção do filtrado e com quatro meses sob congelamento de -18°C a - 15°C.

No dia de realização da análise de NNP, os filtrados representativos das amostras foram descongelados em banho de água à temperatura ambiente (com trocas sucessivas de água) e uma vez sendo alcançada a temperatura ambiente, os frascos foram adicionados de uma barra magnética de 37 mm x 7 mm. Procedeu-se a homogeneização do conteúdo de cada frasco por agitação magnética e uma alíquota de 20 mL de cada um deles foi analítica e exatamente pesada e transferida para os respectivos tubos de digestão. Deste ponto em diante, procedeu-se a adição de sulfato de potássio, solução de sulfato de cobre penta-hidratado a 5% m/v e ácido sulfúrico concentrado, e realizaram-se a

digestão e destilação de forma idêntica àquela empregada na determinação de PB em leite anteriormente descrita, exceto pela adição de antiespumante de emulsão de silicone na quantidade de 4 gotas por tubo. Obteve-se o destilado e a titulação foi realizada contra solução volumétrica de ácido clorídrico 0,01 mol/L de fator de correção conhecido e o

volume foi registrado com sensibilidade ao centésimo do mililitro.

Na determinação do teor em NNP das amostras empregou-se a fórmula definida pela norma International IDF Standard 20B:1993 (IDF, 1993), demonstrada pela equação 9.

Equação 9:

Vs = Volume, em mililitros, da solução volumétrica padronizada de ácido usada na titulação da amostra;

Vb = Volume, em mililitros, da solução volumétrica padronizada de ácido usada no teste branco; M = Molaridade exata, com quatro casas decimais, da solução volumétrica padronizada de ácido

usada = 0,01 x Fc;

Fc = Fator de correção da solução de HCl 0,01 mol/L; Wf = Massa em gramas de 20 mL do filtrado;

Wm = Massa em gramas do leite amostrado;.

Wt = Massa em gramas do leite amostrado mais a massa de solução de ácido tricloroacético adicionada.

4.6.1 Ensaios de branco na determinação de NNP

Conforme a norma International IDF Standard 20B:1993 (IDF, 1993), realizaram-se ensaios em branco para eliminar dos cálculos qualquer incidência de nitrogênio adversa e cumulativa nos reagentes empregados na determinação de NNP. Os ensaios em branco foram conduzidos realizando-se os mesmos procedimentos aplicados à amostra, entretanto o filtrado foi substituído por 16 mL de solução de ácido tricloroacético a 12% m/v e 0,1 g de sacarose de qualidade analítica marca Reagen®. Os ensaios foram realizados em cada dia de análise e os volumes encontrados em mL foram deduzidos dos volumes encontrados quando das análises das amostras.

4.6.2 Avaliação da estabilidade ao congelamento do teor em NNP no soro Foram selecionadas 16 amostras de leite cru

refrigerado de tanques de refrigeração provenientes de duas coletas realizadas em agosto para realizar o ensaio de estabilidade do teor em NNP em função do tempo de estocagem do soro filtrado da precipitação do ácido tricloroacético a 12% m/v. Estas amostras foram submetidas à pesagem de 40 mL de cada uma delas aos quais adicionaram-se 160 mL de solução de ácido tricloroacético a 12% m/v, ambos exata e analiticamente pesados ao 0,1 mg. Foi realizada a agitação leve para precipitação ácida das proteínas e realizada filtração completa em papel de filtro. O soro obtido de cada uma das amostras, amarelo claro e transparente, foi homogeneizado por agitação magnética e dividido em duas porções, uma delas analisada em teor em NNP no dia seguinte à coleta do leite cru refrigerado e a outra porção foi congelada de -15° a -18°C durante 90 dias, após o que foram descongeladas, homogeneizadas por agitação magnética e analisadas em seu teor em NNP conforme o mesmo procedimento de análise. Os dados obtidos foram comparados para se avaliar o

efeito de congelamento por 90 dias do soro tricloroacético sobre a determinação do NNP. 4.6.3 Determinação do teor em proteína verdadeira

Segundo Barbano & Lynch (1992) e Silva (1997), o teor percentual em PV na amostra é calculado deduzindo-se do percentual em NT o percentual em NNP e multiplicando-se o resultado, nitrogênio protéico, por 6,38, o fator do método de Kjeldahl.