Análise do perfil proteico de E cloacae em resposta ao estresse

Para esta análise foram empregadas os isolados de E. cloacae ATCC 49141 e suas sub-culturas resistentes a colistina, bem como, dois isolados clínicos previamente caracterizadas pelo laboratório de referência, nomeado Laboratório Central de Saúde Pública do Distrito Federal (LACEN- DF). Estes isolados clínicos foram isolados do lícor e do sangue de pacientes internados em hospitais de Brasília. Um dos isolados, nomeado como 1437, é resistente aos carbapenêmicos por conter gene Klebsiella pneumonia carbapenemase (KPC), estabelecida pela PCR realizada no LACEN-DF. O isolado 1383 apresenta alto nível de resistência a colistina. Além disso, as análises foram conduzidas com dois focos distintos: (I) análise do lisado celular para determinação da expressão diferencial de proteínas e peptídeos em reposta aos antibióticos; (II) análise do meio de cultura após o cultivo dos isolados com antibióticos em condições sub-inibitórias objetivando detectar os antibióticos e produtos de sua degradação bem como, possíveis peptídeos secretados em resposta ao estresse. Abaixo são descritos as metodologias empregadas nesta análise.

7.7.1. Análise do lisado celular

Estas análises foram realizadas com o intuito de averiguar a presença de massas diferenciais encontradas nos isolados resistentes e ausentes nos susceptíveis isolado bem como, detectar massas que correspondam a proteínas expressas em resposta ao estresse com diferentes antibióticos afim de, caracterizar possíveis biomarcadores de estresse e resistência a antimicrobianos. Com este objetivo, foram então empregados diferentes antibióticos incluindo metanosulfonato sódico de colistina e vancomicina

(Sigma-Aldrich); estreptomicina (ICN Biomedical); penicilina G, cloranfenicol, eritromicina hidratada, tobramicina (USB t m). Foram preparadas soluções estoque na concentração de 10 mg.ml- 1, em água estéril, de todos os antibióticos utilizados.

Em seguida essas soluções foram diluídas em meio LB para a obtenção da concentração sub-inibitória (1/2 CIM) estabelecida conforme metodologia

descrita no item 7.5.2. Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CIM) pelo método de mi crodilui ção. Os isol ados foram cul tivados em LB- ágar sem antibiótico, bem como em LB-ágar contendo a concentração sub- inibitória (1/2 CIM) dos antibióticos descritos acima. Após 12 h de incubação

a 37 ˚C, 10 colônias da isolado cultivada sem antibiótico ou da isolado submetida ao estresse com os diferentes antibióticos foram lisadas com etanol 70% e extraídas com acetonitrila 100% e ácido fórmico (70%) na proporção 1:1 (v/v), conforme metodologia descrita no item 7.5.2. Posteriormente, 1 μL das proteínas extraídas do lisado celular foram aplicadas na placa do MALDI. Após a completa secagem da placa foi aplicada uma alíquota de 1µ L de solução matrix CHCA. As análises foram conduzidas no espectrômetro de massa MicroFlex LT (BrukerDaltonics), em modo linear positivo, usando o método MBT, com faixa de detecção de 2000-20.000 Da, onde obteve-se 35 espectros. Além disso, também foram realizadas análises AutoFlex (BrukerDaltonics), em modo refletido positivo, usando duas faixas de detecção, incluindo 700-3.500Da e 100-1000Da, onde obteve-se 10 espectros em cada faixa e detecção.

7.7.2. Análise do secretoma

Tendo em vista que, a presença de β-lactamases pode ser detectada no meio em decorrência da degradação do anel β-lactâmico, juntamente com a possibilidade da bactéria secretar para o meio compostos em reposta ao estresse, nós analisamos o meio onde bactéria foi cultivada de acordo com a

metodologia descrita por Sparbier e colaboradores (2011). Para tanto, preparou-se um pré- inóculo contendo uma colônia de cada isolado foi cultivada em 5mL de meio LB, por 12 h a 37 ºC, e 200 rpm. Posteriormente, uma alíquota de 50 µ L do pré-inóculo foi cultivado em 2 mL de meio LB, contendo a concentração sub-inibitória (1/2 CIM) dos antibióticos descritos

acima. Após 3 h de incubação a 37 ˚C, a cultura foi centrifugada a 13.000 x g por 2 minutos para separar as células do meio de cultura. Em seguida, o sobrenadante foi filtrado em membrana de 0.22 µ m e um microlitro do sobrenadante livre de células foi aplicado diretamente na placa do MALDI. Após a completa secagem da placa foi aplicada uma alíquota de 1 µ L de solução matrix CHCA. As análises foram conduzidas no espectrômetro de massa AutoFlex (BrukerDaltonics), em modo refletido positivo, usando a faixa de detecção de 100-1000Da, onde obteve-se 10 espectros em cada faixa e detecção. Para a calibração empregou-se o calibrante P2 (BrukerDaltonics). Como controle negativo, avaliou-se meio livre de antibiótico e o meio em associação com o antibiótico.

7.8. ENSAIOS DE COMBINAÇÃO DE ANTIMICROBIANOS CONTRA ISOLADOS DE E. cloacae

Com o propósito de fornecer uma nova terapia no combate a bactérias resistentes a colistina, antibióticos e peptídeosforam combinados e avaliados contra isolados de E. cloacae. Para tanto, foram empregados diferentes antibióticos incluindo a colistina, a vancomicina, o cloranfenicol, a ampicilina e a eritromicina além do, peptídeo antimicrobiano HHC-10. Nesta análise foram empregadas 2 isolados clínicos de E. cloacae, 1437710 e 1383251, previamente caracterizadas pelo LACEN-DF bem como, uma das sub-culturas de E. cloacae ATCC 49141 resistentes à colistina, a isolado R3. A avaliação do possível efeito sinérgico dos antimicrobianos foi realizada

pelo método de microdiluição em tabuleiro de xadrez denominado no inglês, Checkerboard Microdiluti on Assay, que permit e avali ar se a ativi dade antimicrobiana compostos combinados é maior, equivalente ou ainda menor que a atividade de agentes antimicrobianos sozinhos. Primeiramente, estabeleceu-se o CIM de cada um dos antibióticos utilizados, conforme descrito previamente no item 7.5.2. Determinação da Concentração Mínima Inibitóri a (C IM) pel o método de microdiluição. As concentrações avali adas para a obtenção do CIM foram de 0 a 512 µ g.mL- 1. Para a determinação das concentrações combinadas dos antibióticos realizou-se uma diluição a partir do ½ CIM de ambos os antimicrobianos. Os antibióticos onde não foi possível determinar o CIM, realizou-se uma diluição a partir 512µ g.mL- 1.Para a combinação dos antimicrobianos fez-se necessário o ajuste da concentração dos mesmos. Para tanto, iniciou-se com uma concentração estoque 4 vezes maior que a concentração pretendida, uma vez que ela seria ajustada ao final do experimento para uma proporção de 1:4 pois o volume final do ensaio, consite em 100 µ L, 50 µ L do inóculo, 25 µ L do agente antimicrobiano A e 25 µ L do agente antimicrobiano B. Alíquotas de 25 μL de cada agente antimicrobiano e 50 μL do inóculo bacteriano (1x106 _UFC.mL- 1_{) foram}

inseridas nos poços da microplaca. Após a homegeninização as concentrações dos agentes antimicrobianos foram automaticamente ajustadas e a suspensão bacteriana atingiu concentração final de aproximadamente 5x105 UFC.mL-

1_{.Como controle negativo, o inóculo bacteriano foi cultivado sem a adição do}

antibiótico e ainda, para aassegurar de que não houve contaminação do meio, este foi avaliado sem a adição de bactéria e antibiótico. Todos os ensaios foram realizados em quadriplicata. O crescimento bacteriano foi observado após incubação das microplacas a 37 °C por aproximdamente 18 h. A atividade bactericida foi estabelicida após o cultivo em meio LB ágar. A ausência de crescimento no meio LB ágar indicou a ausência de células viáveis e, portanto efeito bactericida, já nas placas onde houve o crescimento, verificou-se o efeito bacteriostático. Após a confirmação do efeito bactericida das combinações dos antimicrobianos testados, o resultado foi interpretado de acordo com o cálculo de índice de concentração inibitória fracional (ICIF), conforme a equação abaixo:

O ICIF foi interpretado da seguinte forma: ICIF < 0.5 (sinergismo); 0.5 < ICIF < 4 (indiferente) e ICIF > 4 (antagonismo) (Gordon, 2010).