Identificação de E cloacae

Com o intuito de assegurar que os isolados de E. cloacae (ATCC 49141), e suas sub-culturas induzidas a resistência (R1, R2, R3) e seus respectivos controles (NR1, NR2 e NR3) fossem identificados com acurácia, empregou-se 2 métodos de identificação incluindo a avaliação do espectro proteico por meio do MALDI BioTyper bem como, a análise através de provas bioquímicas, onde foram utilizados o Mini Kit para Enterobactérias (Newprov) e os métodos automatizados (Vitek e MicroScan).

7.3.1. _{Identificação bacteriana utilizando-se provas bioquímicas}

7.3.1.1. Kit comercial

Os isolados de E. cloacae ATCC 49141 e suas sub-culturas resistentes a colistina (R1, R2 e R3) e controles susceptíveis a colistina (NR1, NR2 e NR3) foram cultivadas em meio Mueller-Hinton agar por 12 h a 37ºC. Posteriormente, isolou-se uma colônia para a avaliação nos diferentes meios e todos os procedimentos foram realizados de acordo com o manual da Newprov. O Mini Kit para Enterobactérias (Newprov) apresentam os testes de Triptofano-Desaminase, H2S, Glicose, Gás, Lisina, Motilidade, Indol,

Ornitina, Citrato e Rhamnose. A avaliação foi realizada em caldo lisina, cuja finalidade é observar a descarboxilação do L-lisina; caldo rhamnose, para fermentação de rhamnose; meio citrato, para averiguar a utilização do citrato como única fonte de carbono; meio EPM para a determinação de desaminação do L-Triptofano (LTD), fermentação de glicose, produção de gás e H2S; meio

7.3.1.2. Identificação da espécie por métodos automatizados (Vitek 2 e MicroScan)

Os pré-inóculos de E. cloacae ATCC 49141 e suas sub-culturas foram cultivados em LB-ágar e depois em placas de MacConkey a 37 ˚C for 16 h. Foram preparadas suspensões bacterianas dessas linhagens de duas formas distintas conforme as orientações dos fabricantes. Para a avaliação no Vitek, foram selecionadas 1-3 colônias de cada linhagem que posteriormente, foram diluidas em salina 0.9 % e, por conseguinte, a turbidez foi mensurada no equipamento DensiChek® (bioMérieux) e ajustada para o padrão 0.5 McFarland. A suspensão bacteriana foi então, inoculada no cartão de identificação ID-GNBcard do VITEK® 2 (bioMérieux) para a identificação de bactérias Gram-negativas. Para a avaliação no MicroScan, a suspensão bacteriana foi preparada utilizando o sistema PromptTM Inoculation para seleção da quantidade de colônias adequadas que foram diluídas em uma solução padronizada do fabricante e todos os painéis de teste do sistema MicroScan® WalkAway® (Siemens) foram carregados com o auxílio do inoculador Renok rehydrating. O painel-teste MC50 foi utilizado para a identificação. Para a identificação, através dos sistemas automatizados, os resultados obtidos para um organismo desconhecido são comparados ao respectivo banco de dados taxonômico específico no intuito de determinar um valor quantitativo de proximidade entre o resultado observado e o banco de dados analisado e a porcentagem de probabilidade foi calculada. Diferentes níveis qualitativos de confiança de identificação são obtidos baseados na probabilidade calculada, como 96-99 % de probabilidade, excelente; 93-95 %, muito bom; 89-92 %, bom; 85-88%, aceitável e outros valores diferentes são classificados como baixa discriminação ou organismo não identificado.

7.3.2. Identificação das espécies bacterianas via MALDI BioTyper

Para uma maior acurácia da identificação bacteriana, primeiramente realizou-se a extração proteica, conforme a metodologia descrita por Calderaro (2012). Os isolados de E. cloacae ATCC 49141 e suas sub-culturas foram cultivadas em meio Mueller-Hinton-ágar, a 37 ˚C por 12 h. Posteriormente, 6 colônias de cada isolado foram removidas e transferidas para 1 tubo contendo 1 mL de etanol 70%. As amostras foram agitadas vigorosamente e depois centrifugadas a 6.900 g, por 2 min a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado, e o sedimento ressuspenso em 10 μL de solução de extração contendo, acetonitrila (100%) e ácido fórmico (70%) na proporção 1:1 (v/v). As amostras foram novamente centrifugadas, e uma alíquota de 1 μL do sobrenadante foi aplicada sobre a placa de MALDI (BrukerDaltonics). Em seguida, uma alíquota de 1 µ L de solução de matriz (ácido α-ciano-4-hidróxi cinâmico (CHCA) em 50 % acetonitrila e 0.3 % ácido trifluoroacético) foi adicionada sobre o poço contendo a amostra. Por conseguinte, de cada isolado foram obtidos 24 espectros no espectrômetro de massa MicroFlex LRF (BrukerDaltonics), em modo linear positivo, usando método MBT com uma faixa de detecção de massas entre 2000 a 20000 Da. Os espectros foram comparados com o banco de dados do MALDI Biotyper versão 3.0, contendo 3995 referências de micro- organimos. A análise foi conduzida com parâmetros padrões de algorítmo de reconhecimento dos perfis protéicos obtidos pela amostra em comparação com o banco de dados do MALDI Biotyper versão 3.0. Para tal análise foi empregada à lista de massas, contendo a itensidade e frequência com que determinada massa aparece após a adição de 500 tiros de laser, para a aquisição de um único espectro. A identificação é interpretada de acordo com o log fornecido, que por sua vez, é definido entre um intervalo de 0-3. Um log (score) ≤ 1,7 é indicativo de uma estreita relação em nível de gênero e um log (score) ≥ 2.0 é indicativo de boa correlação em nível de espécie.

7.4. DENDROGRAMA DA PROJEÇÃO DO ESPECTRO MÉDIO (MSP)

Com o intuito de averiguar as diferenças entre os isolados resistentes e susceptíveis à colistina construiu-se um espectro médio dos 24 espectros oriundos dos isolados de E. cloacae ATCC 49141 e suas sub-culturas susceptíveis e resistentes à colistina. Além disso, para analisar a resposta ao estresse com os antibióticos, construíu-se um espectro médio dos 35 espectros advindos da isolado estressada com os diferentes antibióticos em comparação com a mesma isolado sem antibiótico. Para a criação do espectro médio (MSP), todas as etapas de processamento foram realizadas automaticamente usando o software Biotyper (Bruker Daltonics), onde foram considerados os parâmetros padrão tais como, a tolerância de distância de 300, e função de correção da intensidade em 0.25. A construção do dendograma baseado nos MSPs de cada uma dos isolados, também foi realizada com o padrão do software Biotyper (Bruker Daltonics), que consiste em analíses das massas em uma faixa de 3000 a 15000 Da, com a resolução igual a 1, e a intensidade determinada pelo algoritimo Savitzky Golay.

7.5. AVALIAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE DE E. cloacae ATCC 49141 E