3 Material e Métodos
3.7 Análise dos transcritos do gene PRP
3.7.1 Isolamento de RNA total de Leishmania spp.
O RNA total dos parasitos foi isolado com fenol/guanidina isotiocianato (Trizol) (Invitrogen). Cerca de 1x108 células foram utilizadas para 1 mL de Trizol. Estas eram homogeneizadas e incubadas por 5 minutos a temperatura ambiente. A seguir, 200
Material e Métodos µL de clorofórmio eram adicionados e a amostra era centrifugada 12.000xg por 15 minutos a 4 oC. A fase aquosa era transferida a um novo tubo contendo 500 µL de isopropanol gelado sendo incubada por 10 minutos a temperatura ambiente. Centrifugava-se a 12.000xg por 10 minutos a 4 oC e o sobrenadante era descartado e o RNA precipitado lavado com etanol 75%. Misturava-se as amostras no vórtex e centrifugava-se a 7.500xg por 5 minutos a 4 oC. O sobrenadante era descartado e o RNA seco a temperatura ambiente. Em seguida, ressuspendia-se em água tratada com 0,1% de dietilpirocarbonato (DEPC) e a seguir a amostra era armazenada em freezer -80 oC.
Para as amostras de RNA utilizadas em ensaios de PCR em tempo real, o RNA dos parasitos foi purificado através do kit RNeasy Plus Mini kit (Qiagen) segundo as instruções do fabricante e então analisadas no Bioanalyzer 2100 (Agilent).
3.7.2 Northern blot
Foi utilizado o protocolo descrito por Sambrook, Fritish e Maniatis (1989). Cerca de 15 a 20 µg de RNA total (4,5 µL) foram misturados com 2 µL de tampão de corrida 5x (0,1 M de MOPS [pH 7,0]; 40 mM de acetato de sódio; 5 mM de EDTA [pH 8,0]), 3,5 µL de formaldeído 12,3 M e 10 µL de formamida deionizada (Gibco-BRL). As amostras foram incubadas por 15 minutos a 65 oC e então colocadas no gelo. A cada amostra foi adicionado tampão de amostra para RNA (50% de glicerol; 1 mM de EDTA, pH 8,0; 0,25% de azul de bromofenol; 0,25% de xileno cianol). O padrão de peso molecular utilizado foi o RNA ladder (Invitrogen). As amostras foram aplicadas em gel de agarose 1% dissolvido em água tratada com 0,1% de DEPC contendo uma concentração final de formaldeído 2,2 M e tampão de corrida 1x
Material e Métodos (como descrito acima). As amostras foram submetidas a uma corrida de 80 V por 1 hora. Em seguida, o gel foi tratado com acetato de amônio 0,1 M e corado com brometo de etídio. O gel foi fotografado e então enxaguado com água tratada com DEPC para remoção do formaldeído. O gel era então transferido para uma pilha de papel 3 MM molhado com SSC 20x. A membrana de náilon (Gibco-BRL) era colocada sobre o gel e depois papel 3MM e papel toalha. Sob a pilha de papel era colocado um peso de cerca de 0,4 kg para aumentar a eficiência da transferência do RNA para a membrana ficando por 14 a 18 horas. Após a transferência, fez-se o “cross-linking” no aparelho GS Gene Linker UV chamber (Bio-Rad) para a fixação do RNA na membrana.
Para a hibridização com sonda marcada radioativamente (conforme descrito no item 3.6.2), a membrana era colocada em saco plástico devidamente vedado contendo solução de pré-hibridização (SSC 5X, 0,1%, de SDS Denhardt´s 2x, 50% de formamida) e incubado a 42 oC por um mínimo de 4horas. Após este período a sonda previamente incubada a 100 oC por 10 minutos era colocada no saco plástico que era então devidamente vedado incubando a membrana em banho a 42 oC por 16 a 24 horas. A solução de hibridização era descartada e lavava-se a membrana com agitação em solução de SSC 1x, SDS 0,1% a temperatura ambiente por 20 minutos seguida por 3 lavagens de 20 minutos cada de SSC 0,2x, SDS 0,1% a 68oC. A membrana era envolta em filme plástico e exposta a um filme autorradiográfico.
Material e Métodos
3.7.3 RT-PCR
Para o mapeamento dos sítios de trans-splicing e poliadenilação do RNAm do gene PRP1 foi utilizado RNA total isolado de células selvagens de L. major e de células transfectadas com os cosmídeos cosPen1-A e pSNBR/8kb Sma I-A.
Para o mapeamento do sítio de trans-splicing, 2-5 µg de RNA total foi combinado com água DEPC e 1 µL do iniciador (10 µM) PRP15´2, 5´ TGA CAG CTC GTT CAC AGC 3´ para uma mistura de 11 µL que foi incubada a 65 °C por 5 minutos. Este iniciador é antisense e corresponde a região 5´ do gene PRP1 (região amino terminal). Em seguida, a mistura foi incubada no gelo por 5 minutos e adicionou-se 4 µL de First-Strand Buffer 5x (250 mM de Tris-HCl, 375 mM de KCl, 15 mM de MgCl2), 2 µL de DTT 0,1 M, 1 µL de dNTPs (10 mM de cada nucleotídeo dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 µL de RNaseOUTTM Recombinant Ribonuclease Inhibitor (40 U/µL) (Invitrogen) e 1 µL de Superscript II Reverse Transcriptase (200 U/µL) (Invitrogen) para um volume final de 20 µL. Essa mistura foi incubada a 42 °C por 50 minutos terminando a reação com uma incubação a 70 °C por 15 minutos. Adicionou-se então 1 µL de RNase H (2 U/µL) (Invitrogen) incubando a amostra por 20 minutos a 37 °C. O tubo de reação era armazenado a -20 ºC. Para a amplificação do cDNA sintetizado uma PCR foi feita utilizando 2 µL do produto da reação anterior, 5 µL de PCR buffer 10x, 1,5 µL de MgCl2 50 mM, 1 µL de dNTPs, 1 µL de cada iniciador (10 µM) PRP15´1: 5´ CAA CAG AGC GCC ACA GCA CAC 3´, este interno ao iniciador PRP15´2 e SL: 5´ CGC TAT ATA AGT ATC AGT TTC 3´ este último baseado na seqüência de miniexon.
Material e Métodos Para o sítio de poliadenilação, o mesmo protocolo descrito acima foi utilizado. O iniciador AP constituído por um oligodT: 5´ GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACT TTT TTT TTT TTT TTT T 3´ foi utilizado para a síntese de cDNA. Para a reação da PCR foram utilizados os iniciadores AUAP: 5´ GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC 3´ e PRP13´2: 5´ TCA GCT ACC TTT CCG ACA 3´.
Os transcritos correpondentes ao gene PRP1 foram detectados utilizando um primer específico PRP1R: 5´ GCG GTC GAC GCC TCA TCG CTC TCT AC 3´ para síntese de cDNA e os iniciadores NBD1F e NBD1R para a PCR. As condições utilizadas foram as mesmas para aquelas descritas anteriormente.
Os produtos amplificados foram separados em um gel de agarose 1,2%, purificado pelo kit GeneClean II (Bio 101, Inc.) e clonados nos vetores pGEM-T e/ou pGEM-T Easy (Promega). Os DNAs isolados foram seqüenciados conforme descrito no item 3.5.7 de Material e Métodos.
3.7.4 RT-PCR em tempo real
Iniciadores para o gene PRP1 de L. major foram desenhados a partir do Programa GeneRunner (http://www.generunner.com) (PRP1F2: 5´ CGGCAGCTCAGCTACC TTTC 3´ e PRP1R2: 5´ CACAGTGTCCAGTGCAAACATG 3´). Os iniciadores do gene Amastina de L. infantum estavam previamente disponíveis no Laboratório do Prof. Marc Ouellette (AmastinaF: 5´ TAG CTT GCC CGC GGC CGC CTT CAC TTC ATT e AmastinaR: 5´ GCA AGT GGG TTT TTT TTT CGC). Para a síntese do cDNA, 50 ng de RNA total foi utilizado em presença da enzima SuperscriptIITM RNase H- Reverse Transcriptase (Invitrogen) e Oligo (dT)
12-18 (Invitrogen) segundo as instruções do fabricante.
Material e Métodos
O PCR em tempo real foi realizado em triplicata em volumes de 25 µL utilizando o SYBR Green Supermix (Bio-Rad) e detectado no Rotor Gene-3000 (Corbett Research) segundo protocolo previamente descrito (GAGNON et al., 2006; LEPROHON et al., 2006). As condições de reação da PCR em tempo real foram: 95oC por 4 minutos, seguido por 30 ciclos de 95 oC por 20 segundos, 62 oC por 20 segundos e 72 oC por 20 segundos. A quantidade relativa do produto de PCR gerado de cada par de iniciadores foi determinado baseando-se no valor do ciclo limiar (Ct) e na eficência da amplificação. As reações eram normalizadas dividindo os valores pela quantidade relativa de expressão do gene GAPDH utilizado como controle e amplificado com os seguintes iniciadores (GAPDHF: 5´ GAA GTA CAC GGT GGA GGC TG 3´ e GAPDHR: 5´ CGC TGA TCA CGA CCT TCT TC 3´).