3 Material e Métodos
4.12 Caracterização molecular dos mutantes de L amazonensis resistentes à pentamidina
Em Leishmania spp., a amplificação gênica constitui um importante mecanismo relacionado com células resistentes à drogas (BEVERLEY, 1991; OUELLETTE, BORST, 1991; SEGOVIA, 1994; BORST, OUELLETTE, 1995). Os produtos oriundos da amplificação de DNA apresentam-se em múltiplas cópias de DNAs extracromossomais lineares e/ou circulares e podem constituir de 5 a 10% do DNA genômico total (CODERRE et al., 1983; BEVERLEY et al., 1984; ELLENBERGER, BEVERLEY 1989; OLMO et al., 1995). Diante desses dados, estudos moleculares através da análise do DNA genômico dos parasitos mutantes resistentes à pentamidina de L. amazonensis foram realizados, com o intuito de verificar a existência de possíveis DNAs amplificados nesses mutantes.
Inicialmente, foi verificado a presença de possíveis fragmentos de restrição amplificados nas linhagens resistentes à pentamidina, através da digestão de DNA genômico total. No entanto, nenhuma banda mostrou-se mais intensa nos mutantes PENr 0,5 e PENr 5 comparado com os parasitos selvagens (Fig. 26A). Investigou-se ainda a presença de DNAs circulares através de um protocolo padrão de extração de DNA plasmidial através de lise alcalina. A análise através da eletroforese em gel de agarose mostrou a ausência de amplificação, com exceção dos parasitos controle transfectados com o plasmídeo pSP1.2LUCαHYGα (Fig. 26B). Finalmente, um PFGE foi realizado contendo os cromossomos dos parasitos mutantes e selvagens, porém nenhuma amplificação foi observada nesta análise (Fig. 26C). Esses dados mostram que nenhum sinal de amplificação de DNA foi observado nesses mutantes,
Resultados quando comparado com os parasitos selvagens, indicando que o mecanismo de resistência não deve estar relacionado com a amplificação gênica (Fig. 26). No caso de mutantes resistentes ao metotrexato, antimônias, terbinafina e anfotericina B observa-se facilmente a presença de DNA amplificados em análises através da digestão total de DNA genômico dos parasitos resistentes (ELLENBERGER; BEVERLEY, 1989; SINGH; PAPADOPOULOU; OUELLETTE, 2001).
Figura 26. Caracterização molecular dos mutantes resistentes à pentamidina de L. amazonensis para
a detecção de DNAs amplificados. (A) Análise em eletroforese em gel de agarose do DNA genômico dos parasitos digeridos com as enzimas de restrição indicadas. O padrão de peso molecular está indicado à esquerda em kb. (B) Análise em eletroforese em gel de agarose de DNAs ciculares isolados por protocolo padrão através de lise alcalina. O padrão de peso molecular está indicado à esquerda em kb. A seta indica o DNA do plasmídeo pSP1.2LUCαHYGα. (C) PFGE dos cromossomos do parasito selvagem e dos mutantes PENr 0,5 e PENr 5. O padrão de peso molecular está indicado à esquerda em Mb e corresponde aos cromossomos de Saccharomyces cerevisiae (Bio-Rad). Legenda: 1 – L. amazonensis; 2 - PENr 0,5; 3 - PENr 5; 4 - L. amazonensis transfectada com o
Resultados Conforme descrito neste estudo, a amplificação e a consequente superexpressão do gene PRP1 é capaz de conferir resistência à pentamidina em transfectantes de L. major assim como em outras espécies de Leishmania. Considerando que a amplificação desse gene poderia conferir resistência à pentamidina, analisou-se por Southern blot o DNA dos parasitos mutantes utilizando como sonda um fragmento específico do gene PRP1 de L. major. Esses dados indicaram a ausência de amplificação do gene PRP1 (Fig. 27). A análise por FIGE e PFGE mostrou somente o DNA amplificado do plasmídeo PRP1 (pSNBR/8 Kb SmaI- A) nos parasitos transfectados com esse DNA circular (Fig. 27A e Fig. 27B). Os experimentos de Southern blot das análises realizadas por FIGE e PFGE indicaram um forte sinal nos DNA circulares amplificados que contêm o gene PRP1 (plasmídeo pSNBR/8 Kb SmaI-A), enquanto que nenhum sinal significativo foi observado nos mutantes PENr 0,5 e PENr 5, comparado com o parasito selvagem (Fig. 27A e Fig. 27B). Finalmente, o Southern blot realizado a partir de DNA genômico dos parasitos mutantes e selvagem digerido com a enzima de restrição PstI, mostrou a ausência de amplificação do gene PRP1, indicando definitivamente que esse gene não se encontra amplificado nos mutantes PENr 0,5 e PENr 5 (Fig. 27C).
Resultados
Figura 27. Caracterização molecular dos mutantes resistentes à pentamidina de L. amazonensis para
a detecção de amplificação do gene PRP1. (A) PFGE dos cromossomos dos parasitos selvagem e dos mutantes PENr 0,5 e PENr 5. O padrão de peso molecular está indicado à
esquerda em kb e corresponde aos concatâmeros do fago λ. (B) FIGE dos cromossomos dos parasitos selvagem e dos mutantes PENr 0,5 e PENr 5. O padrão de peso molecular está indicado à esquerda em kb e corresponde ao 8-48 kb ladder (Bio-Rad) e o DNA do fago λ digerido com HindIII. O DNA de ambos os géis (A e B) foram transferidos para membrana de nylon, e hibridizados com um fragmento de DNA PvuII de 1,2 kb do gene
Resultados
PRP1 correspondendo ao 2º domíno transmembrana da PRP1 de L. major. (C) Análise por
Southern blot para detecção de amplificação do gene PRP1. O DNA dos parasitos foram digeridos com a enzima de restrição PstI e hibridizado com a mesma sonda descrita acima. O padrão de peso molecular está indicado à esquerda em kb e corresponde ao DNA do fago λ digerido com HindIII. Essa membrana foi rehibridizada com uma sonda do gene de Tubulina. Legenda: 1 – L. amazonensis; 2 - PENr 0.5; 3 - PENr 5; 4 - L.
amazonensis transfectada com o plasmídeo pSNBR/8kb SmaI-A. c – zona de compressão.
Finalmente foi verificado se os mutantes resistentes à pentamidina apresentavam alterações na expressão do gene PRP1, uma vez que já foi demonstrado alterações nos níveis de RNAm de genes não associados à amplificação gênica (GUIMOND et al., 2003; MARQUIS et al., 2005). Inicialmente, foi realizado um ensaio de RT-PCR a partir de RNA total dos parasitos e foi detectado a presença de transcritos do gene PRP1 nas três linhagens estudadas, utilizando duas diferentes estratégias (Fig. 28). Para a quantificação desses transcritos foram realizados ensaios de RT-PCR em tempo real a partir de RNA total de formas promastigotas da linhagem selvagem e dos mutantes PENr 0,5 e PENr 5. Conforme representado na Figura 29, não foram observadas alterações significativas nos níveis de transcritos do gene PRP1, ao comparar os mutantes com o parasito selvagem.
Resultados
A
B
Figura 28. Identificação de transcritos do gene PRP1 nos mutantes resistentes à pentamidina PENr
0,5 e PENr 5. Produtos de RT-PCR amplificados com os iniciadores degenerados NBD1F e NBD1R (A) ou PRP1F2 e PRP1R2 (B) e analisados em eletroforese em gel de agarose 1,2%. Para a síntese de cDNA foi utilizado um primer específico do gene PRP1 de L.
major (PRP1R) em presença de Transcriptase Reversa (+) (A) ou oligodT (B). O produto
específico de cerca de 80 pb está indicado por uma seta (B). Para o controle negativo da reação da Transcriptase Reversa, a mesma reação foi realizada em ausência de Transcriptase Reversa (-). Nenhuma amplificação foi obtida em ausência de cDNA. Legenda: 1 – L. amazonensis; 2 – PENr 0,5; 3 – PENr 5.
Resultados 0.0 0.5 1.0 PENr 0.5 PENr 5 La Ra z ã o de e x p re ss ão
Figura 29. Análise da expressão do gene PRP1 por RT-PCR em tempo real em formas promastigotas
de L. amazonensis e dos mutantes PENr 0,5 e PENr 5. A razão de expressão do gene
PRP1 dos mutantes PENr 0,5 e PENr 5 relativo as formas promastigotas de L. amazonensis são mostrados. Os resultados são uma média de três experimentos
independentes preparados a partir de três diferentes preparações de RNA. Legenda: La –
Discussão