3 Material e Métodos
3.5 Identificação de genes da família de transportadores ABC de Leishmania spp.
3.5.1 PCR
Para a identificação de genes da família de transportadores ABC foram utilizados iniciadores degenerados baseados nas seqüências que codificam os motivos Walker A/B relacionados com a ligação de ATP (Nucleotide Binding Domain). Foram desenhados iniciadores baseados no gene PRP1 de L. major (GenBank accession number AY251609) e outros membros da subfamília ABCC de Leishmania spp: PGPE de L. tropica (U55381); PGPB de L. tarentolae (L29484); PGPE de L. tarentolae (L29485) e PGP2 de T. cruzi (Z49222). Os iniciadores degenerados baseados no gene PRP1 foram: NBD1F 5´ GCG gaa ttc CYG CGM GSR MRG YTG ACR GTK GTG 3´ e NBD1R 5´ GCG gtc gac MGT SGC YAG CAC GCG CGT CTT GCC 3´. Os iniciadores descritos anteriormente contêm os sítios de restrição para as enzimas EcoRI e SalI respectivamente (representados em letras minúsculas) com o intuito de facilitar a clonagem dos fragmentos amplificados no vetor pUC19.
As reações de PCR foram realizadas em volume final de 50 µL contendo 10 mM de Tris-HCl pH 8,8; 50 mM de KCl; 1,0 mM de MgCl2; 200 µM de cada dNTP; 0,2 µM de cada primer utilizado; 0,05 U/µL de Taq DNA polimerase (Amershan Pharmacia ou Fermentas) e cerca de 100 ng de DNA genômico de Leishmania spp. Sobre a reação foram ainda adicionados cerca de 30 µL de óleo mineral. As amostras foram amplificadas em um Termociclador PTC-100TM (MJ Research, Inc.)
Material e Métodos com as seguintes condições de reação: 94 oC por 3 minutos, seguido por 30 ciclos de 94 oC por 1 minuto, 55 oC por 1 minuto e 72 oC por 2 minutos seguido de um ciclo final a 72 oC por 7 minutos. Os produtos amplificados foram analisados em eletroforese em gel de agarose e purificados com o kit GeneClean (Bio 101 Inc.). Os produtos purificados foram digeridos com as enzimas EcoRI e SalI e então ligados no plasmídeo pUC19 também digerido com as mesmas enzimas. Alguns fragmentos obtidos através da PCR continham sítios para as enzimas descritas acima e foram clonados no vetor pGEM-T Easy (Promega) conforme as instruções do fabricante.
3.5.2 Ligação dos fragmentos de DNA amplificados em vetor específico
Para ligação foi utilizado 100 ng de DNA do vetor pUC19 e 300 ng do produto de DNA amplificado ambos previamente digeridos com as enzimas EcoRI e SalI, 1 µL da enzima T4 DNA ligase (Invitrogen) e 2 µl do tampão de reação da enzima T4 DNA ligase 5x (250 mM de Tris-HCl [pH 7,6]; 50 mM de MgCl2; 5 mM de ATP; 5 mM de DTT; 25% de PEG-8000 [m/v]) para um volume final de 10 µL. A suspensão foi incubada por 12 horas a 14 °C. Após este período, o produto de ligação era utilizado na transformação de bactérias.
3.5.3 Processo de transformação em bactérias
O processo utilizado foi baseado no protocolo descrito por Chung e Miller (1988) com algumas modificações no processo que torna as bactérias competentes. A bactéria utilizada na transformação foi a E. coli (DH10-β). Inicialmente, preparou- se um pré-inóculo a partir de uma colônia da bactéria DH10-β em 5 mL de meio LB,
Material e Métodos e após 14 horas de incubação a 37 °C, a cultura foi diluída 1/100 em LB. Após mais 2 horas de incubação na mesma temperatura, esta nova cultura foi centrifugada a 1.000xg por 10 minutos a 4 °C e ressuspensa em 1/10 do volume total com TSB gelado. Cerca de 100 µL desta suspensão bacteriana gelada era adicionada a pelo menos 10 ng de cada DNA a ser transformado. A suspensão contendo o DNA era mantida no gelo por um período de 30 minutos sendo adicionado em seguida 900 µL de TSB glicose incubando por 2 horas a 37 °C com agitação constante. Após a centrifugação da cultura a 2.650xg por 1 minuto, esta foi plaqueada em placa de Petri contendo LBA sólido e incubada por 12-18 horas a 37 °C.
Alternativamente bactérias competentes foram preparadas com cloreto de cálcio e transformadas conforme protocolo descrito (SAMBROOK; FRITISH; MANIATIS, 1989).
3.5.4 Extração do DNA do plasmídeo de culturas de E. coli
Inicialmente, coletava-se uma colônia recombinante da placa de Petri contendo o produto de transformação do item anterior. Cada colônia era inoculada em um tubo com 4 mL de LBA líquido, sendo incubado a 37 oC sob agitação constante durante 14 horas. Após a incubação, as células em suspensão eram centrifugadas a 1.300xg durante 10 minutos e o sobrenadante descartado. As células eram ressuspensas em 100 µL da solução contendo 25 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM de EDTA (pH 8,0) e 50 mM de glicose e transferidas para um tubo de microcentrífuga, onde eram adicionados 200 µL da solução de NaOH 0,2 M; SDS 1%. Homogeneizava-se por inversão e incubava-se a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos. A seguir,
Material e Métodos adicionava-se 200 µL de solução de ácido acético glacial 6 M e acetato de potássio 3 M e incubava-se no gelo durante 25 minutos. A suspensão era centrifugada a 13°C a 16.100xg durante 8 minutos, sendo que cerca de 400 µL do sobrenadante era transferido para outro tubo contendo 300 µL de isopropanol. Centrifugava-se novamente a 13 °C a 16.100xg durante 8 minutos. O DNA precipitado era lavado com 500 µL etanol 70% (v/v em água bidestilada, deionizada e autoclavada) e centrifugado durante 8 minutos a 16.100xg a 13 °C. O sobrenadante era removido e o tubo contendo o DNA precipitado era seco em estufa a 42 °C durante 30 minutos. Após esse período, o DNA era finalmente ressuspenso em 40 µL de TE RNase e incubado por 30 minutos a 37 oC.
3.5.5 Digestão dos DNAs dos plasmídeos com enzimas de restrição
Uma vez isolados, os DNAs eram submetidos a digestões totais com as enzimas de restrição. Para a digestão, era utilizado cerca de 1 a 5 µg do DNA obtido da etapa anterior, 1 µL da enzima de restrição a ser utilizada (10 U/µL) (Fermentas), 1 µL do tampão de reação 10x apropriado da enzima utilizada e água bidestilada, deionizada e autoclavada, para um volume final de 10 µL. As digestões foram processadas sempre em um período de 4 horas a temperatura adequada conforme orientação do fabricante. Digestões duplas foram processadas nas mesmas condições das descritas acima em digestões simples, porém foi utilizado um tampão compatível com as duas enzimas selecionadas. Os DNAs digeridos com as enzimas selecionadas eram analisados através de uma eletroforese em gel de agarose.
Material e Métodos
3.5.6 Eletroforese em gel de agarose
Foi utilizada agarose (Invitrogen) dissolvida em tampão de corrida TAE 1x ou TBE 1x que era solubilizada através do aquecimento em forno microondas. A todas as amostras foi adicionado tampão de amostra de DNA (0,25% de azul de bromofenol, 0,25% de xileno cianol e 20% de glicerol). Os padrões de peso molecular utilizados foram o DNA do bacteriófago Lambda (λ) digerido com Hind III (Invitrogen) apresentando os seguintes fragmentos de DNA em quilobase (kb): 23,1; 9,4; 6,5; 4,4; 2,3; 2,0 e 0,6, o 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen) contendo os seguintes fragmentos em kb: 12; 11; 10; 9; 8; 7; 6; 5; 4; 3; 2; 1,65; 1; 0,85; 0,65; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2; 0,1 ou o O´Gene Ruler 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas) que contém os seguintes fragmentos em kb: 3,0; 2,0; 1,5; 1,2; 1,0; 0,9; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2; 0,1. As corridas eletroforéticas foram realizadas em voltagem e tempo de acordo com o produto a ser analisado. A seguir, o gel era corado com brometo de etídio (0,5 µg/mL) durante 15 minutos ao abrigo de luz. O padrão de bandas obtido era analisado em transiluminador sob fonte de luz UV e o gel fotografado em sistema de documentação fotográfico Polaroid DS34 com filme 667 ou em Câmera Digital Nikon Coolpix 4300.
3.5.7 Seqüenciamento de nucleotídeos
O seqüenciamento foi processado em um seqüenciador automático modelo MegaBACE 1000 (GE Healthcare), em conjunto com o kit DYEnamic ET Dye Terminator Kit (GE Healthcare), que utiliza processos de química fluorescente para a leitura dos resultados. As condições de reação são fornecidas pelo fabricante e o
Material e Métodos método de seqüenciamento segue o processo clássico dos didesoxirribonucleotídeos descrito originalmente por Sanger, Nicklen e Coulson (1977).
A análise das seqüências foram feitas utilizando os programas DNAstar (Madison, WI) e Clone Manager 6TM e via rede de computadores no GenBank através do BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (ALTSCHUL et al., 1990) no sítio (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), no sítio do Projeto Genoma de Leishmania major (http://www.sanger.ac.uk/Projects/L_major/index.shtml), Leishmania infantum (http://www.sanger.ac.uk/Projects/L_infantum/index.shtml) e no GeneDB (http://www.genedb.org/).