Caracterização molecular do gene PRP1 de L major

O transportador PRP1 pertence à família de transportadores ABC (ATP-binding cassette) que é bastante conservada, com membros descritos em todos os reinos de seres vivos (HIGGINS, 1992). Recentemente, o transportador PRP1 foi classificado como membro da subfamília ABCC (ABCC7), que é constituída por 8 membros (LEPROHON et al., 2006). A PRP1 (ABCC7) apresenta identidade de 37,9%, 38,7%, 37,9%, 35,6%, 38%, 38,4% e 18,6% com os transportadores ABCC de L. major ABCC1, ABCC2, ABCC3 (MRPA), ABCC4, ABCC5, ABCC6 e ABCC8 respectivamente. É importante salientar que dentre os demais membros da subfamília ABCC, apenas o ABCC3 (MRPA) está envolvido na resistência à drogas em Leishmania (CALLAHAN; BEVERLEY, 1991; PAPADOPOULOU et al., 1994; EL FADILI et al., 2005).

A análise da organização genômica do gene PRP1 em L. major por Southern blot mostrou que este gene é de cópia única (Fig. 2). Neste experimento foi utilizado como sonda o fragmento PstI de 0,8 kb que codifica o 1o domínio de ligação de ATP cuja região é bastante conservada entre os membros da família de transportadores ABC (Fig. 1) (HIGGINS, 1992; LÉGARE; HETTEMA; OUELLETTE, 1994). Pode-se verificar que os fragmentos hibridizados correspondiam àqueles representados no mapa, indicando ainda a ausência de outras cópias desse gene (Fig. 1 e Fig. 2). Na Figura 2, pode-se observar fracas bandas em algumas digestões, o que pode refletir a hibridização com outros genes membros da família de transportadores ABC, como já observado anteriormente quando utilizado sonda do gene MRPA (PGPA), um outro membro dessa família de transportadores em Leismania (LÉGARE; HETTEMA; OUELLETTE, 1994).

Resultados

Figura 2. Análise por Southern blot do DNA genômico de L. major (Friedlin A1). Cerca de 5 µg de

DNA genômico foi digerido, fracionado em gel de agarose 0,9%, transferido para membrana de nylon e hibridizado com a sonda NBDI (Fig. 1). Nenhuma das enzimas utilizadas digere a sonda de 0,8 kb exceto XhoI (Fig. 1). Os marcadores de peso molecular são derivados do DNA do fago λ digerido com HindIII. Enzimas de restrição: 1, BamHI; 2,

Resultados Estão presentes no genoma de Leishmania 42 membros da família de transportadores ABC (LEPROHON, 2006). As análises através do sítio do Projeto Genoma de L. major confirmaram a ausência de outras cópias do gene PRP1 estando localizado no cromossomo 31 (1.500 kb) de L. major. O ortólogo do gene PRP1 foi identificado através da análise do projeto Genoma de L. infantum estando localizado no cromossomo 31 também de 1.500 kb, e este apresentava identidade de 93,1% com o gene PRP1 de L. major. A seqüência de nucleotídeos do gene PRP1 de L. braziliensis ainda não se encontrava disponível no Projeto Genoma desse parasito até a conclusão deste estudo.

A análise da seqüência de nucleotídeos da região genômica do gene PRP1 indicou a ausência de outros membros da família de transportadores ABC. A 5´ do gene PRP1 há uma fase de leitura de 1.005 nucleotídeos que codifica uma proteína de 335 aminoácidos que apresenta identidade de 15% com a GP46 de L. chagasi (AAB62271). A 3´ do gene PRP1 há uma fase de leitura de 2.631 nucleotídeos que codifica uma proteína de 877 aminoácidos que não apresenta similaridade com proteínas já depositadas em bancos genômicos. Ambos os genes tinham a mesma orientação de transcrição que o gene PRP1.

A análise do padrão de transcrição do gene PRP1 em L. major (Friedlin A1) por Northern blot identificou um grande transcrito maior que 10 kb a partir de RNA total do transfectante cosPEN1-A (Fig. 3B), enquanto que um transcrito de 6 kb assim como um outro de 4,4 kb foi detectado a partir de RNA total do transfectante pSNBR/8kb SmaI-A (Fig. 3A). Essa variação no tamanho dos transcritos de diferentes transfectantes, cujo inserto que contém o gene de resistência varia em tamanho, já foi observada em Leishmania spp. (HENDERSON et al., 1992; CHOW et al., 1993). Entretanto, nenhum sinal de hibridização foi observado a partir do RNA

Resultados total de L. major tanto em fase logarítmica, quanto em fase estacionária de crescimento (Fig. 3A e Fig. 3B). Apesar de não ter sido detectado nenhum sinal de hibridização por ensaios de Northern blot em RNA total de parasitos promastigotas selvagens, os ensaios por RT-PCR, a partir de RNA total de L. major, e dos transfectantes cosPen1-A e pSNBR/8kb SmaI-A, evidenciaram a presença do fragmento de DNA específico de 618 pb correspondente a região que codifica o 1º domínio de ligação de ATP da PRP1 (Fig. 3C) e que foi confirmado pelo sequenciamento dos produtos amplificados (dados não mostrados). Esses dados indicam que a expressão do gene PRP1 em promastigotas selvagens ocorre em baixos níveis. Resultados similares já foram observados em genes de outros transportadores ABC em Leishmania spp e Trypanosoma brucei. (HENDERSON et al., 1992; PAPADOPOULOU et al., 1994; MASER; KAMINSKY, 1998; MARCHINI et al., 2003; PARODI-TALICE et al., 2003; ANACLETO et al., 2003; KATAKURA et al., 2004).

O sítio de trans-splincing do transcrito do gene PRP1 foi mapeado e identificado a 358 nucleotídeos do códon de iniciação (Fig. 4A). Pelo menos dois sítios de poliadenilação do transcrito do gene PRP1, identificados a 260 e 361 nucleotídeos do códon de terminação, são utilizados no processamento do RNAm (Fig. 4B).

Resultados

Figura 3. Análise do transcrito do gene PRP1 de L. major. (A) Análise por Northern blot de RNA total

de promastigotas L. major e de transfectantes com o gene PRP1. Cerca de 5 µg de RNA total de L. major de fase logarítmica (1); fase estacionária (2); e de fase logarítmica do transfectante pSNBR/8 kb SmaI-A (3) foi fracionado em gel de agarose 1%, transferido para membrana de nylon e hibridizado com a sonda NBDI, correspondendo a um fragmento de 0,8 Kb PstI (Fig. 1D). (B) Cerca de 10 µg de RNA total de L. major de fase logarítmica (1), e de fase logarítmica do transfectante cosPEN1-A (2) foi fracionado em gel de agarose 1%, transferido para membrana de nylon e hibridizado com a sonda NBDI. (C) Produtos de RT-PCR amplificados com os iniciadores degenerados NBD1F e NBD1R que correspondem à seqüência de nucleotídeos que codifica ao 1o domínio de ligação de ATP da PRP1 e de outros membros da subfamília ABCC. Para a síntese de cDNA foi utilizado um primer específico do gene PRP1 (PRP1R). (-) Controle negativo da reação de PCR (ausência de cDNA); (RT-) Reação para síntese de cDNA com RNA total de promastigotas de fase logarítmica em ausência de Transcriptase Reversa; (1) RT-PCR a partir de RNA total de L. major fase logarítmica; (2) RT-PCR a partir de RNA total do transfectante pSNBR/8 kb SmaI-A; e do transfectante cosPEN1-A (3).

Resultados

A

-1002 AGTGAAGGGCTGCCTGAATGGGAGCTTCGGGAGGCGGATACAGCGGACACTTAGATGTGTGGAGGGCGTCATGGCATCACTGCAACGCAC -912 CCTGCTTCGAATCAGTCGCCGCCACTGCGCCTGCGTGCGCGGTGCACGGAGAGGCCGCCCTGGGTGTAAGGTGTGGCTTGCGGTCGCATT -822 GCCTGTGCCACCGCCACACTCCGTGAGCCGTCTGCTGCCCCGGTGCGCACCATGGCTTTCGTCCTCTCTCGGGCATCGCTCTTCTCAGGC -732 GGCTGTGCGCATCGCTGCGCTGCACTGCGCCTTTGCGCCCGCTCACATCAGGTATGGCTGTGAGGCGAACTGCGTGGCATGCACAGCTCG -642 TGCGCGGCCGCGTGCCGTTGTGCTGCTTGCCTTGCTCCATTTACTTGGCTCCTTCTCTCCGTGCCCGCCTCTGTTTTGACCACCCGCTGT -552 GCGTCGTCCGGCGACCCTTTCGCGGTGATGCCTCATTGCGGCAGCGCAGCGGCATCACCGTCAGCGCTGTGTGTGCTGCGTCTCTTGCTC -462 ACTCTCTCCCTCTCTTGCGAAGGCTTGCAGCACCTCACTTGCCACTTCGCTCGATCTATTCTTTCTCTTTTTGTGCTGCGCTGGGCCGCA -372 CCACCACAGCGTTAGTGACCGCACACCGCTCCCCACCGAGGCTTCCACGGCTGCTGCACATGCGTGGACGGCATTTGCGCAGCTCAGCTG -282 CCGGCGTTGGCTAACGAGGCCGTCTTCTTTGCAGGACCACCCGATGCAGCAGCGCGACACGGCCAAGTCAATTGTGTGTGTGTTTTGGCT -192 GCTTAGCCCGCTGCGATAGGCGTGCCGGCAGGCAGCTGTCGTCTCCCCTGTCGCCGGAGTGCTCGCCCTCCCTGCACCACATGCATTGCG -102 AGCCGCCCGAGCGCTACACGATCCTCTTAGTCTTGCCACGCTTGGTGCACCCTTTCGGCGCACGCTGCATCTTGCCCCTCCGACCCTTGG -12 CATCGGAGATCG 1 ATGAGCAGCCAGCGACCGGAGATGTCAGAAGGGCCAGCGAGTTATAGCGCCCACTCGTTCGGCGAGGTCAACCGACGGCTGTGGCGGTTG M S S Q R P E M S E G P A S Y S A H S F G E V N R R L W R L 30

B

5401 TCGCTCATGCGTCAGTGCAAGTGA S L M R Q C K - 1807 5425 CTGCGCATCTCTGCAAGTCTTCATTTCAGCGAGGCAAACCTCGCGCCCGGTAGGGTGTCGCTTTTTGCCCGTTGTTTTTATTGTATGCAA 5515 CACCGTGTTGTGCGATTGCCTCTTCGCGGCGGGGTGGAGAAGCTTGGAAGGAGGGAGACGGTGTGGCACACGAGGATTTACTAGCGATCC 5605 GATTCGATGAAGTGGTTGCCATGCTGCCTTTTTTTGCCCGTGTTGAGAGGTGCTGTGAGACGGGGGTGACATCGCGGCAAACATCTCCAT 5695 CGATTCCACGTTGTTTCACTCGCTGAGTGCGATGGCTGGCATGAAGGCTTGTCGTTGATGACGTCATGTGAGATGAGCAAGGGTTCCGCT 5785 GATTCTCTTCGTTTCACTCAAGCCGGCTTGTTTCCCGTGCGTGCTGGTGACTTCCCATGCCGGTGCCAGGTTTTACATCTGGTGTGTGCA 5875 ACACGTGTGCGTGCATTTCTTCAGCTTGACTTTTTCTCATGCCTCTTCGTCTTTTCCTTCTTTCTGCTCGTCTCCGAAATACTGTCGCTC 5965 CATATCTTTTCTTCCTCCCACCTCTCTTGCCCACACCTTGTACTCACCGGAGCCGTCCCCGTGATCGCCCGCCACAACTTGCTCCGCTAG 6055 TGCCCTCGTCTTGTCAACCAGCTATAGCGTAGAATGCACAGGCACGATTGATTTCTTCTTTTGTGACCTCTGCGCACCAGTGATACGCTG 6145 CTTTTTCAACATCGTGTTGCCAATCCAGTTACGTGCGCCTGGCTCATTCAAGCCCATAGTCTCGCGATCCGTTTCTCCC

Figura 4. Sítios de processamento do RNAm do gene PRP1. (A) O dinucleotídeo AG aceptor de

trans-splicing está indicado na posição –358 (negrito e sublinhado) do códon de início de tradução. Os tratos de polipirimidina que precedem o sítio aceptor de trans-splicing estão sublinhados. (B) Os sítios de poliadenilação nas posições +260 e +361 do códon de terminação estão indicados (negrito e sublinhado).

No documento Papel do transportador ABC PRP1 na resistência à pentamidina em Leishmania spp (páginas 88-93)