Análise da expressão do gene gsn e acúmulo de glicogênio durante o choque térmico

Resultados anteriores obtidos em nosso laboratório mostraram que os níveis de RNAm gsn foram reduzidos quando micélio da linhagem selvagem do fungo foi submetida ao choque térmico (DE PAULA et al., 2002). A fim de confirmarmos se esta redução é resultante do aumento de temperatura, analisamos a transcrição do gene gsn sob diferentes temperaturas de crescimento. Paralelamente, o acúmulo de glicogênio foi determinado nas mesmas amostras. Em outro tipo de experimento, a análise da expressão do gene gsn foi realizada nas diferentes linhagens do fungo alteradas na via de sinalização mediada por AMPc.

________________________________________________________Materiais e Métodos

2.1. Condições de cultivo das linhagens

Conídios da linhagem selvagem do fungo foram germinados a 30°C durante 24 h. Uma alíquota (amostra controle) foi removida e armazenada a -80°C enquanto o restante da cultura foi filtrado, o micélio obtido foi fracionado e as frações foram submetidas a diferentes temperaturas de crescimento (35, 37, 40, 42 e 45ºC) em meio VM líquido fresco pré-aquecido nas temperaturas estabelecidas. Após 30 min de incubação, amostras das diferentes temperaturas foram coletadas e armazenadas como no controle. Estas amostras foram usadas para a extração de RNA total e para a determinação do conteúdo de glicogênio.

Para estudar o papel do AMPc sobre a transcrição do gene gsn, conídios das linhagens selvagem, mcb e cr-1 foram germinados a 30°C durante 24 h. Alíquotas das diferentes culturas foram removidas e armazenadas a -80°C (amostras controles). As culturas restantes foram filtradas, os micélios obtidos foram inoculados em meio VM líquido fresco pré-aquecido a 45°C e incubados nesta temperatura durante 30 min (amostras HS30). Após o choque térmico, as amostras foram coletadas e armazenadas como no controle. Estas amostras foram usadas para a extração de RNA total e análise da expressão por Northern Blot.

2.2. Extração de RNA total

RNA total das amostras de ambas análises foi extraído pelo método de cloreto do lítio (SOKOLOVSKY et al., 1995). Para isto, conídios ou micélio do fungo foram pulverizados em gral de porcelana com nitrogênio liquido e os pós resultantes foram transferidos para tubos eppendorf contendo uma mistura de 750 μL de tampão de lise: 750 μL fenol saturado em Tris-HCl 0,1 M pH 8,0. A suspensão foi agitada durante 20 min à temperatura ambiente e a fase aquosa foi coletada a 10.000 rpm/10 min/ 4ºC. Os RNAs contidos nas fases aquosas foram precipitados com 0,75 volumes de uma solução LiCl 8 M a 4ºC, durante uma noite e coletados a 13.000 rpm/10 min/4ºC. Os precipitados contendo os ácidos nucléicos foram solubilizados em 300 μL de água e em seguida, precipitados com acetato de sódio 3 M e etanol absoluto gelado a -80ºC, durante 30 min. Os RNAs totais foram coletados a 13.000 rpm/4ºC, durante 15 min, lavados duas vezes com uma solução de etanol 70% gelada a 13.000 rpm/4ºC, durante 5 min, secos e solubilizados em 50 a 100 μL de água (DEPC).

Todos os materiais usados para a extração e eletroforese de RNA foram previamente tratados com RNaseZap® (Ambion).

2.3. Análise da expressão gênica por Northern blot

A análise por Northern blot foi realizada segundo protocolo descrito por SAMBROOK & RUSSELL (2001). Para isto, aproximadamente 15 μg de cada amostra de RNA total foi

________________________________________________________Materiais e Métodos

previamente desnaturada em tampão de desnaturação a 65ºC durante 10 min. As amostras desnaturadas foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1,5% contendo formaldeído 0,6 M, em tampão MOPS 1x. Os RNAs totais foram separados a 3,5 V/cm durante 5 h e em seguida, transferidos por capilaridade para membranas de Nylon neutras (Hybond N, GE HealthCare) utilizando solução tampão SSC 2x, durante uma noite. Após a transferência, os RNAs foram fixados na membrana por crosslinking (Ultraviolet Crosslinker UVP mod. CL1000) durante 1 min e as membranas foram lavadas em solução tampão SSC 2x até a total remoção do formaldeído. As membranas lavadas foram pré-hibridizadas a 42ºC, durante 4 h com 5 mL da solução ULTRAhyb (Ambion), em forno de hibridização Hybaid. Após o período de pré-hibridização, foram adicionados cerca de 100 ng de sonda (106 – 108 cpm) previamente desnaturada a 100ºC/10 min e as membranas foram hibridizadas durante uma noite. As membranas hibridizadas foram lavadas em diferentes condições de estringência antes de serem expostas a filmes radiográficos (Kodak T-Mat G/RA).

Condições de lavagem: 1) SSPE 2x - 15 min/42°C 2) SSPE 0,5x; SDS 0,1% - 15 min/42°C 3) SSPE 0,1x; SDS 0,1% - 15 min/42°C 4) SSPE 0,1x; SDS 0,1% - 30 min/65°C

2.3.1. Sondas utilizadas

Como sonda para a análise por Northern blot foi utilizado o fragmento inteiro do cDNA

gsn de aproximadamente 3,0 kb (DE PAULA et al., 2002). Para um controle interno da

hibridização, foi usado o gene que codifica a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gpd) de

N. crassa. O gene gpd foi amplificado a partir do DNA genômico do fungo, utilizando os

oligonucleotídeos específicos GAPDH-NcF e GAPDH-NcR, subclonado no vetor pMOSBlue e seqüenciado para a confirmação do inserto. As sondas foram marcadas radiativamente com α[32_{P]dATP por random priming (NEBlot kit - Biolabs) e em seguida, foram purificadas por}

filtração em resina Sephadex G-50 (Sigma) equilibrada em tampão NT, a fim de eliminarmos os nucleotídeos não incorporados.

2.4. Determinação do conteúdo de glicogênio

O conteúdo de glicogênio foi determinado nas células da linhagem selvagem do fungo, submetidas ou não ao choque térmico, através da digestão do glicogênio com amiloglicosidase após precipitação com etanol, de acordo com protocolo descrito por HARDY & ROACH (1993).

________________________________________________________Materiais e Métodos

Para isto, micélio de cada uma das amostras foi pulverizado em gral de porcelana com nitrogênio líquido até a obtenção de um pó fino. Em seguida, as amostras foram homogeneizadas em tampão de extração gelado recém preparado, as frações solúveis contendo os extratos protéicos foram isoladas por centrifugação a 7.000 x g /4°C/15 min e as proteínas totais foram dosadas com reagente de Bradford (BioRad), utilizando BSA como padrão. As proteínas contidas em 100 μL de cada uma das amostras foram precipitadas com 25 μL de uma solução TCA 50% a 10.000 x g /4°C/15 min. Os sobrenadantes foram então transferidos para novos tubos, misturados com 4 volumes de etanol absoluto gelado durante 30 min a -80°C e centrifugados a 20.000 x g /4°C/15 min. Os precipitados contendo glicogênio foram então resuspensos em 400 μL de uma solução tampão (acetato de sódio 0,05 M pH 5,2; CaCl2 0,005 M) contendo 1 μL de cada uma das enzimas amiloglicosidase (30

mg/mL, em tampão acetato de sódio 0,05 M pH 5,2; CaCl2 0,005 M) e α-amilase (10 mg/mL,

em tampão acetato de sódio 0,05 M pH 5,2; CaCl2 0,005 M) e incubados a 37°C durante 12 h.

Um volume de 25 μL de cada uma das amostras digeridas foi utilizado para a determinação do conteúdo de glicose livre, utilizando o kit Glucose Trinder (Sigma). O conteúdo de glicogênio foi expresso em μg glicogênio/mg de proteínas totais.