Resultados Região 5’ flanqueadora
3- Identificação de proteínas envolvidas no controle transcricional do gene gsn durante o choque térmico
Uma outra etapa do nosso trabalho consistiu em tentar identificar a(s) proteína(s) capaz(es) de reconhecer e ligar o elemento STRE da região promotora do gene gsn, uma vez que a transcrição é regulada negativamente na situação de estresse térmico e proteínas foram mostradas se ligarem ao consenso deste elemento. Ensaios de retardamento em gel mostraram que duas das frações obtidas após cromatografia de afinidade do extrato nuclear HS30 apresentaram alta atividade de ligação DNA-proteína(s) para o elemento STRE1. Em
S. cerevisiae, os elementos STRE são bastante conhecidos por mediar respostas a diferentes
formas de estresse, independente de sua orientação no promotor (KOBAYASHI & McENTEE, 1993). Uma análise computacional prévia do genoma da levedura revelou que 186 dos genes analisados eram potencialmente regulados por STRE (MOSKVINA et al., 1998). Nas leveduras, as respostas mediadas pelos elementos STRE frente a diferentes formas de estresse são dependentes da presença dos transativadores do tipo zinc finger Msn2p/4p no núcleo das células (MARTINEZ-PASTOR et al., 1996; SCHMITT & MCENTEE, 1996). Decidimos então realizar uma busca de ortólogos aos transativadores Msn2p/4p em bancos de dados de N. crassa, mas não foram encontrados ortólogos.
Dando continuidade à nossa proposta de identificação, as proteínas existentes no extrato HS30 bruto e nas frações após cromatografia apresentando atividade de ligação ao elemento STRE foram fracionadas por SDS-PAGE e com o auxílio de técnicas de renaturação e hibridização (Southwestern) identificamos as primeiras proteínas por espectrometria de massas. A ORF NCU02424 mostrou uma proteína potencialmente interessante para investigação futura. Esta ORF codifica uma proteína que se caracteriza por apresentar um domínio de ligação DnaJ localizado na extremidade C-terminal e três domínios tetratricopeptídicos localizados na extremidade N-terminal (Fig. 26A). O domínio DnaJ é responsável por regular a função chaperona das proteínas da família Hsp70, mediando interações diretas entre diferentes proteínas chaperonas da família Hsp70 e proteínas do tipo DnaJ (CYR et al.,1994). Os domínios tetratricopeptídicos (domínios TPR) são estruturas presentes em uma grande variedade de proteínas, desde bactérias até humanos, responsáveis por estabelecer interações proteína-proteína e a formação de multi-complexos
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protéicos (DAS et al., 1998). As proteínas da família Hsp70 representam uma classe de chaperonas muito bem conhecida, que atualmente tem se destacado por seu papel na regulação transcricional. Em Cryptococcus neoformans a proteína Ssa1, ortóloga Hsp70, mostrou agir como uma proteína coativadora da transcrição do gene que codifica o fator de virulência do fungo, através da sua ligação em uma seqüência de DNA rica em GC localizada na região 5’-UAS em resposta a situações estressantes variadas como privação de glicose, alterações de temperatura e presença de metais como ferro, cobre e cálcio. Além disso, durante a indução da expressão gênica a proteína Ssa1 mostrou formar um complexo protéico regulatório com os fatores de transcrição HSF e TBP e sua deleção resulta numa resposta virulenta atenuada, reforçando o papel de coativador transcricional desta representante Hsp70 (ZHANG et al., 2006).
Os ensaios realizados para investigar a provável massa molecular da(s) proteína(s) que ligam no elemento STRE do promotor gsn revelaram que as proteínas candidatas apresentam massa molecular ao redor de 40-50 kDa. O provável ponto isoelétrico das proteínas candidatas foi investigado e os resultados obtidos mostraram a presença de frações protéicas de dois pontos isoelétricos diferentes com atividade de ligação ao consenso STRE1, sugerindo a existência de, pelo menos, dois grupos de proteínas capazes de ligar ao elemento STRE. O fracionamento do extrato obtido após cromatografia, através de eletroforese bidimensional, permitiu isolar e identificar por MALDI-TOF/TOF todas as proteínas contidas no intervalo de massa molecular de 40-50 kDa. Dentre as proteínas identificadas (Tabela 3), a maioria delas encontra-se anotada como proteína hipotética e após análise de suas seqüências polipeptídicas, algumas foram consideradas alvos altamente promissores.
O primeiro alvo interessante foi uma proteína codificada pela ORF NCU01021, anotada como relacionada ao fator de iniciação da tradução 3 (eIF3). A análise da seqüência polipeptídica revelou a presença de um domínio Mov3/MPN/PAD-1 (Fig. 26B) localizado na extremidade N-terminal da proteína. Os domínios Mov3/MPN/PAD-1 são encontrados não apenas em subunidades regulatórias do proteossomo 26S mas também nas subunidades eIF3 e reguladores de fatores de transcrição. As proteínas JAB1 (humanos) e pad1 (Schizossacharomyces pombe), Mov34 ortólogas, mostraram potencializar seletivamente a transcrição gênica por reconhecer e ligar no consenso regulatório AP-1 (SHIMANUKI et al., 1995; CLARET et al., 1996).
A ORF NCU03876, anotada como sendo uma proteína hipotética, provavelmente relacionada com a subunidade p39 do fator eIF3, mostrou após análise da sua seqüência polipeptídica a presença de domínios WD40 localizados nas extremidades N e C-terminais (Fig. 26C). As proteínas contendo domínios WD40 pertencem a uma grande família de proteínas de eucariotos, envolvidas numa variedade de funções como transdução do sinal e
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controle transcricional. Elas coordenam a formação de complexos multi-protéicos através de seus domínios WD40 os quais sempre terminam em Trp ou Asp. Um exemplo destas proteínas são os fatores ativadores da transcrição TAF5 de S. cerevisiae. Nas leveduras, o fator de transcrição TFIID, fundamental na regulação da expressão gênica pela RNA polimerase II, é formado por um conjunto de proteínas que incluem a proteína TBP e 14 outros fatores associados à proteína TBP (TAFs). Através de microscopia eletrônica foi observado que este conjunto de proteínas encontra-se organizado em 3 regiões unidas entre si por ligações delicadas e um imuno-mapeamento mostrou que estas ligações eram resultantes dos domínios WD presentes em duas cópias dos fatores TAF5 localizados nestas regiões (LEURENT et al., 2004)
Outra ORF considerada foi a NCU03482, a qual foi anotada como uma proteína hipotética semelhante à helicase do tipo RuvB. As DNA helicases RuvB são importantes, pois fazem parte de complexos protéicos como o Swr1 e Ino80, os quais atuam na remodelagem de cromatina. Enquanto o complexo Swr1 medeia a alteração da histona H2A para sua forma variante de maneira dependente de ATP, o complexo Ino80 remodela a cromatina deslocando os nucleossomos (PAPAMICHOS-CHRONAKIS et al., 2006). A análise da seqüência polipeptídica codificada por esta ORF revelou a presença de um domínio ATPase AAA associado a atividades celulares diversas e também um domínio Tip49 C-terminal (Fig. 26D). As proteínas Tip49 foram inicialmente identificadas como proteínas contendo domínios de interação com a proteína TBP que interagem com vários tipos de fatores nucleares, além de apresentar atividade DNA helicase intrínseca. Um exemplo do controle exercido por Tip49 é a repressão de alguns genes alvo durante os estágios de desenvolvimento normal de
Drosophila pela sua associação com o fator de transcrição dMyc, um órtologo do fator c-myc
de vertebrados. A interação dMyc-Tip 49 mostrou ser bastante forte e interfere em várias etapas de desenvolvimento do animal como a duração do desenvolvimento, a taxa de sobrevivência e tamanho do animal adulto (BELLOSTA et al., 2005).
A ORF NCU06679 correspondente ao gene cac-3 (chromatin assembly-3), um ortólogo do gene CAC-3 de S. cerevisiae também mostrou ser interessante alvo para experimentos posteriores. Uma região rica em aminoácidos básicos (Lys e Arg) localizada na porção C-terminal seqüência protéica foi observada após a análise da seqüência polipeptídica (RHRKTRSR). Seqüências ricas nestes aminoácidos são descritas funcionar como sinais de localização nuclear (NLS) (DINGWALL & LASKEY, 1998). Além disso, vários domínios WD40 (Fig. 25E), cuja importância transcricional já foi descrita anteriormente para a ORF NCU03876, também foram detectados ao longo da proteína. Na levedura S. cerevisiae, os genes CAC (CAC1, CAC2 e CAC3) codificam as proteínas do complexo heterotrimérico