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4. Determinação do promotor basal gsn no fungo N crassa
A determinação do promotor basal gsn em N. crassa foi feita através da determinação qualitativa do acúmulo de glicogênio no fungo. Para isto, foi utilizada uma linhagem do fungo (linhagem gsnrip), a qual foi construída em nosso laboratório por DE PAULA (2004). Trata-se de uma linhagem mutante, a qual possui o gene gsn inativado por RIP (Repeat Induced Point
Mutation). Resumidamente, é uma técnica que se baseia numa característica do fungo N. crassa, onde cópias duplicadas de uma mesma seqüência nucleotídica são mutadas durante
o período pré-meiótico. No período de cruzamento que antecede a fusão nuclear, o genoma do fungo é rastreado para a presença de seqüências duplicadas e quando encontradas, ambas as seqüências são mutadas pontualmente. Tais mutações podem levar à inativação do gene quando ocorrem no início da seqüência nucleotídica e neste caso, a proteína não é sintetizada na linhagem mutante. Portanto, a linhagem gsnrip se caracteriza por não possuir atividade glicogênio sintase e, portanto, ser incapaz de acumular glicogênio.
4.1. Preparo das construções
As construções para a análise do promotor basal no fungo N. crassa foram realizadas através da remoção e combinação de diferentes seqüências nucleotídicas da região promotora do gene gsn, obtidas tanto por PCR, quanto por digestão enzimática. Todas as construções foram realizadas no vetor pBARGEM7-2, o qual carrega o gene gsn inteiro, incluindo suas regiões 5’ e 3’-flanqueadoras. Além do gene gsn inteiro, o vetor pBARGEM7-2 também possui o gene BAR, o qual confere resistência ao glufosinato de amônio (nome comercial: BASTA, Bayer Cropscience do Brasil), um potente inibidor da enzima glutamina sintetase quando em meio de cultivo carente em fonte de nitrogênio (meio Vogel N-free). Portanto, transformantes pBARGEM7-2 podem facilmente ser selecionados em meio Vogel N-free suplementado com 0,5% do aminoácido prolina como única fonte de nitrogênio e adicionado de glufosinato de amônio (PALL, 1993).
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As construções pBARGEM-pm1 a pBARGEM-pm10 correspondem às mesmas construções preparadas no vetor Yep356 de levedura. Uma construção contendo o plasmídeo pBARGEM7-2 vazio (pBARGEM-0) também foi preparada para ser usada como controle negativo. Todas as construções foram checadas por análise de restrição e sequenciamento automático, antes de serem utilizadas para transformar conídios de N.
crassa gsnrip e encontram-se representadas na Figura 7. Para o preparo do plasmídeo pBARGEM7-2 vazio, um fragmento de DNA SmaI-SmaI de 4.888 bp correspondente à ORF e sua região 5’ flanqueadora inteira e parte da região 3’-flanqueadora foi removido do clone IV9A-1 e o vetor restante foi recircularizado.
4.2. Transformação de conídios e seleção dos transformantes
As construções plasmidiais no vetor pBARGEM7-2 foram usadas para transformar a linhagem mutante do fungo, através de eletroporação dos conídios, de acordo com o
protocolo descrito por BORKOVICH & VOLLMER (http://www.brinkmann.com/ELEC_appl_neurospora.asp). Para isso, N. crassa gsnrip foi
cultivada durante 10 dias em meio VM sólido. Os conídios foram coletados, lavados primeiro com água estéril gelada e em seguida, com uma solução de sorbitol 1 M estéril gelada, a 4.000 rpm/4oC/10 min. O precipitado contendo os conídios foi resuspenso em 1 mL da solução de sorbitol 1 M, na concentração de 2 x 107 conídios/mL.
Cerca de 1 μg de cada uma das construções plasmidiais foi utilizada para transformar 100 μL da suspensão de conídios recém-preparada. A transformação foi realizada por eletroporação em cubetas de 0,2 cm, em um eletroporador Gene Pulser II (Bio-Rad), a 25 μF de capacitância, 300 Ω de resistência e 2000 V. Após o pulso elétrico, as cubetas foram acrescidas de 900 μL de uma solução de sorbitol 1 M gelado, homogeneizadas e adicionadas em ágar de regeneração contendo meio Vogel N-free (top agar), homogeneizadas e imediatamente espalhadas na superfície de placas contendo meio Vogel N-free sólido (bottom agar), acrescido de 2% sorbose (para induzir o crescimento colonial) e 250 μg/mL de glufosinato de amônio. Como controle negativo da eletroporação, conídios de N. crassa também foram eletroporados com água estéril. As placas foram incubadas a 30°C, as colônias crescidas isoladas foram transferidas para tubos contendo meio VM sólido sem sorbose e cultivadas durante 10 dias para obtenção de conídios. Os conídios foram posteriormente utilizados para rastrear os clones quanto à capacidade de acumular glicogênio.
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pBARGEM-pm1 pBARGEM -pm2 (ΔHSE)
Promotor gsn
(clone IV9A-1)
pBARGEM -pm3 (ΔHSE ΔSTRE) pBARGEM -pm4 (ΔHSE ΔSTRE ΔTATA) pBARGEM -pm5 (ΔSTRE)
pBARGEM -pm6 (Δintron)
pBARGEM -pm7 (ΔSTRE Δintron)
SmaI ATG SfiI BglIl NcoI KpnI BglIl pBARGEM -pm8 (ΔTATA) pBARGEM -pm10 (TATA) pBARGEM -pm9 (ΔTATA Δintron) gsn gsn gsn gsn gsn gsn gsn gsn gsn gsn gsn pBARGEM-0 (Δgsn) Intron 1
Figura 7. Construções plasmidiais para a análise da região promotora do gene gsn e parte da região
codificadora da enzima glicogênio sintase de N. crassa. Estruturas esquemáticas das construções utilizadas para determinação do promotor basal no fungo, utilizando o vetor pBARGEM7-2. A localização dos sitos de restrição, dos elementos transcricionais cis e dos três prováveis sítios de início de transcrição (TIS) encontram-se representados na região promotora do gene. As regiões hachuradas representam as seqüências nucleotídicas removidas do promotor gsn. ▐ intron 1;▐ elementos HSE; ● elementos STRE; TATA-box motif;
prováveis TIS.
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4.3. Determinação qualitativa do conteúdo de glicogênio nos transformantes de N.
crassa
A inativação do gene gsn por RIP foi feita utilizando-se como linhagem receptora no cruzamento uma linhagem de N. crassa (Bat9-5a), temperatura sensível, que apresenta crescimento colonial em temperaturas maiores ou iguais a 32°C. Desse modo, os transformantes obtidos foram cultivados durante 10 dias em tubos contendo VM sólido sem sorbose, para permitir o crescimento micelial e conidiação. Suspensões conidiais em água estéril de cada clone obtido foram preparadas e 10 μL de cada uma delas foram aplicados em placas de meio VM sem sorbose. A placa foi incubada a 37°C/48 h e ao final deste período, o conteúdo de glicogênio de cada clone foi analisado qualitativamente expondo as colônias dos transformantes aos vapores de iodo durante 5 min. Uma amostra a linhagem gsnrip parental foi ensaiada, juntamente com os clones obtidos após a transformação, como controle negativo do acúmulo de glicogênio.