1 “Electrophoretic Mobility Shift Assay” (EMSA)
1.4. Sondas de DNA e competidores específicos para os elementos de DNA STRE e HSE contidos na região 5’-flanqueadora do gene gsn
Como sondas de DNA, foram analisados segmentos da região 5’-flanqueadora do gene (região promotora mais a região 5’-UTR), os quais foram obtidos por digestão com endonucleases de restrição e por PCR, utilizando-se primers localizados em diferentes posições da região analisada. Estes fragmentos foram subclonados no vetor pUC18 e a presença dos insertos foi confirmada através de sequenciamento de ambas as fitas em seqüenciador automático 377 ABI-PRISM (Perkin Elmer).
1.4.1. Preparo das sondas HSE, HSE1, HSE2 e STRE1 para analisar os elementos de
DNA presentes na região promotora do gene gsn
Um primeiro fragmento de DNA de 377 bp foi amplificado a partir do clone IV9A-1 [FREITAS et al. (2002), GenBank nº AF417205] com os oligonucleotídeos GSN-FP4 e GSN- RP2. O fragmento foi digerido com BglII e NcoI, liberando um fragmento de 158 bp, o qual foi reparado e subclonado em SmaI no vetor pUC18 (pUC-STRE1). A sonda STRE1 foi construída com o objetivo de analisar o envolvimento do elemento STRE1 (upstream ao TATA-box). Para preparo da sonda STRE1, o plasmídeo pUC-STRE1 foi digerido com EcoRI e HindIII liberando um fragmento de 158 bp.
Um segundo fragmento de DNA de 618 bp foi amplificado a partir do clone IV9A-1 com os primers pBARGEM-R e GSN-RP3, o qual foi subclonado em SmaI no vetor pUC18
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(pUC-HSE). A sonda HSE foi construída com o objetivo de analisar uma região do promotor
gsn contendo vários elementos HSE. Para preparo da sonda HSE, o plasmídeo pUC-HSE foi
digerido com EcoRI e HindIII liberando um fragmento de ~630 bp. Posteriormente, a região contendo os elementos HSE foi subdividida em dois fragmentos contendo respectivamente, os elementos HSE distais (sonda HSE1) e os elementos HSEs proximais (sonda HSE2), em relação ao códon de iniciação ATG (+1). Para o preparo da sonda HSE1 um fragmento de DNA de aproximadamente 290 bp foi amplificado a partir do plasmídeo pUC-HSE utilizando os oligonucleotídeos pGSN-F e HSE-R. Este fragmento foi digerido com a enzima de restrição EcoRI e subclonado no vetor pUC18 em SmaI/EcoRI (pUC-HSE1). Para o preparo da sonda HSE1, o plasmídeo pUC-HSE1 foi digerido com EcoRI, liberando um fragmento de DNA de ~250 bp. Para o preparo da sonda HSE2 um fragmento de DNA de aproximadamente 320 bp foi amplificado a partir do plasmídeo pUC-HSE utilizando-se os oligos HSE-F e GSN-RP3, digerido com a enzima de restrição SfiI, reparado e subclonado no vetor pUC18 em SmaI (pUC-HSE2). Para o preparo da sonda HSE2, um fragmento de DNA de 277 bp foi removido do plasmídeo pUC-HSE2 através de digestão enzimática com BamHI e EcoRI.
1.4.2. Preparo das sondas STRE2/HSEi, STRE2 e HSEi para analisar os elementos
de DNA contidos no intron1 da região 5’-UTR do gene gsn
Um fragmento de DNA de aproximadamente 1100 bp foi amplificado a partir do clone IV9A-1, com os oligonucleotídeos pGSN-R e GSN-FP5. Este fragmento foi digerido com
EcoRI e BglII, liberando um fragmento de 610 bp, o qual foi subclonado em EcoRI e BamHI
no vetor pUC18 (pUC-STRE2/HSEi). A sonda STRE2/HSEi foi construída com o objetivo de analisar inicialmente o envolvimento dos elementos de transcrição HSE e STRE2 presentes no intron1 (região 5’-UTR). Para o preparo da sonda STRE2/HSEi, o plasmídeo pUC- STRE2/HSEi foi digerido com XbaI e SalI, liberando um fragmento de 410 bp.
As análises individuais dos elementos transcricionais STRE2 e HSE presentes no
intron1 também foram realizadas. Para isto, foram isolados dois fragmentos de DNA, um
contendo o elemento STRE2 e o outro os elementos HSE. Um fragmento de DNA de aproximadamente 420 bp foi amplificado a partir do clone IV9A-1 com os oligos STRE2i-F e pGSN-R e subclonado no vetor pUC18 em SmaI/EcoRI (pUC-STRE2). Para o preparo da sonda STRE2 o plasmídeo pUC-STRE2 foi digerido com SalI e BamHI, liberando um fragmento de 151 bp. Para o preparo da sonda HSEi, um fragmento de aproximadamente 250 bp foi amplificado com os oligonucleotídeos GSNpm-F e HSEi-R e subclonado no vetor pUC18 em SmaI (pUC-HSEi). A sonda HSEi, contendo 240 bp, foi isolada do plasmídeo pUC- HSEi após digestão enzimática com BamHI e EcoRI.
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1.4.3. Preparo da sonda contendo o elemento STRE1 mutado (mSTRE1)
A especificidade da ligação DNA-proteína(s) para o elemento STRE1 também foi analisada utilizando-se uma sonda de DNA carregando o elemento STRE1 mutado (sonda mSTRE1) e o competidor específico para os elementos HSE do promotor gsn, num ensaio de competição cruzada. O elemento STRE1 foi mutado alterando-se a seqüência 5’-CCCCT-3’ contida no promotor gsn pela seqüência 5’-AAAAg-3’, através da técnica de mutagênese sítio-dirigida, utilizando PCR em duas etapas (AUSUBEL et al., 1996).
Na primeira etapa (PCR 1) foram usados os oligonucleotídeos mSTRE1-F e mSTRE1- R para introduzir as mutações. Um fragmento de DNA de aproximadamente 550 bp foi amplificado a partir do clone IV9A-1 utilizando os oligonucleotídeos mSTRE1-F e GSNpm-R. Outro fragmento de DNA, contendo aproximadamente 600 bp também foi amplificado a partir do clone IV9A-1, utilizando-se os oligonucleotídeos HSE-F e mSTRE1-R. Os fragmentos amplificados foram isolados, purificados, dosados e misturados em quantidades equimolares em tubo eppendorf limpo. A mistura de fragmentos de DNA foi desnaturada e deixada esfriar a temperatura ambiente, a fim de favorecer o anelamento das fitas de DNA complementares. As fitas aneladas carregando o elemento STRE1 mutado foram estendidas a 72ºC/5 min, adicionando-se previamente à reação uma mistura de dNTPs e a DNA polimerase Platinum
Pfx DNA polimerase (Invitrogen). Na segunda etapa (PCR 2), os oligonucleotídeos GSN-FP4
e GSN-RP2, localizados internamente ao fragmento de DNA amplificado no PCR1, foram usados para amplificar um fragmento de aproximadamente 380 bp, o qual foi subclonado no vetor pMOSBlue (pMOS-mSTRE1) e posteriormente, seqüenciado. A sonda mSTRE1 de 158 bp foi isolada do plasmídeo pMOS-mSTRE1 após digestão enzimática com BglII e NcoI.
1.4.4. Competidores específicos e inespecíficos para as sondas utilizadas
Os competidores específicos para as sondas acima mencionadas foram preparados como as mesmas, sem sofrerem marcação radiativa. Oligonucleotídeos STRE1 complementares também foram usados como competidores específicos para o elemento STRE1, após terem sido anelados entre si. Os oligonucleotídeos hibridizados foram quantificados através da absorbância a 260 nm antes de serem usados como competidores nos ensaios de EMSA. Como competidor inespecífico, foi usado o copolímero poli(dI-dC)•(dI- dC) (GE Healthcare).